胃旁路術對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的影響

高向楠 柴 芳 趙樹鵬 (遼寧醫學院附屬第一醫院普外科，遼寧 錦州 121001)

目前對2型糖尿病(T2DM)的治療以內科方式為主，如控制飲食、增加運動、口服各種降糖藥及注射胰島素等，但血糖控制不理想遠期效果差。胃旁路術(RYGB)手術治療T2DM，術后短期就可控制血糖、降低體重且遠期效果較好〔1〕。研究發現RYGB可以改善T2DM患者胰島β細胞凋亡程度〔2〕，但其作用機制仍不清楚。本研究觀察RYGB術后β-catenin及內質網(ER)相關凋亡蛋白caspase-12的表達，探討RYGB對糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與藥品 鏈脲佐菌素(STZ)購買于Sigma生物公司，β-catenin、caspase-12抗體、胰島細胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢博士德生物公司。

1.2T2DM動物模型建立和分組 健康雄性SD大鼠60只，10周齡，體重210～243 g(由遼寧醫學院實驗動物中心提供)。所有大鼠清潔級飼養，室溫(22±2)℃，相對濕度40%左右，12 h光照，自由進食水，適應環境3 d后隨機分成正常對照組(C組)，糖尿病控制大鼠手術組(RYGB)和假手術組(S-RYGB)各20只。糖尿病組大鼠給予高脂飼料(50%脂肪，10%碳水化合物，2%膽固醇和5%正常食物)飼養3 w，于2 w時腹腔注射STZ(25 mg/kg)。20只正常SD大鼠作為健康組給予同等量的鹽水注射。2型糖尿病大鼠在注射STZ 3 d后測量空腹血糖≥16.7 mmol/L且穩定1 w為造模成功〔3〕。成模大鼠(RYGB組17只、S-RYGB組15只)和C組同條件下飼養。

1.3RYGB模型制作 手術組大鼠術前12 h禁食，采用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重經腹腔給藥麻醉。RYGB組取腹正中做4 cm長切口，逐層入腹。胃大小彎間進行離斷，保留賁門附近約20%胃體并保護迷走神經，距十二指腸懸韌帶下方約10 cm處橫斷空腸，遠端上提與殘胃吻合，在距吻合口約10 cm處行空腸近端與空腸端側吻合。C組和S-RYGB組分別作為陰性和陽性對照，與手術組相同操作開腹，行胃切開術在胃前壁做7 mm切口后予以縫合。所有大鼠吻合口均用6-0無損傷線縫合，理順腸道后用青霉素(40 000 U/kg)和生理鹽水沖洗腹腔，并給予適量生理鹽水補液后關腹。術后禁食2 d后給予正常飲食，禁食期間給予10%葡萄糖溶液口服。所有大鼠飼養4 w后處死。

1.4血糖、體重檢測 測量術前和術后1、2、3、4 w大鼠空腹血糖和體重，測定空腹血糖前需禁食12 h。

1.5TUNEL檢測胰島β細胞凋亡率 處死大鼠后分離胰腺組織，測定胰島細胞凋亡率，按TUNEL檢測試劑盒說明操作。用DAB顯色凋亡陽性細胞。每份樣品高倍鏡下隨機選取視野(×400)，計數100個細胞核，計算胰島細胞凋亡率。

1.6免疫組化檢測胰腺組織β-catenin、caspase-12蛋白表達胰腺組織用4%多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋，石蠟組織4 μm切片后使用二甲苯和梯度乙醇(由高到低)依次脫蠟和水化，切片使用枸櫞酸鈉溶液進行抗原修復。冷卻至室溫后滴加封閉液，按SABC檢測試劑盒說明操作。陽性結果為胞質/膜出現棕黃色區域。根據染色強度及陽性細胞數進行分級。染色程度:基本不著色為0分;染色淡者為1分;著色適中者為2分;著色深者為3分。陽性細胞百分比:著色細胞數占計數細胞＜5%為0分;6% ～25%為1分;26% ～50%為2分;≥51%為3分。將每張切片著色程度和著色細胞百分比得分相加，最后得分0～3分為陰性表達，≥4分為陽性表達。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，χ2檢驗。

2結果

2.1存活率 C組死亡5只，存活率75%，3只因為傷口裂開于術后4 d死亡，2只因為腸壞死于術后3～5 d死亡;RYGB組死亡3只，存活率82%，2只因為術后吻合口漏引起腹膜炎，于術后第1～3天死亡，1只因小腸壞死于術后4 d死亡;S-RYGB組死亡2只，存活率87%，均因小腸壞死于術后5 d死亡。

2.2體重變化 術后1 w各組大鼠體重均下降，術后2 w起RYGB組體重降低顯著低于相應時間點C組和S-RYGB組(P＜0.05)。見表1。

2.3空腹血糖變化 RYGB組術后第1周空腹血糖值已開始下降，術后第4周空腹血糖值為(3.9±0.7)mmol/L，明顯低于相應時間點S-RYGB組(P＜0.05)。S-RYGB組、C組實驗過程中空腹血糖值無明顯改變。見表1。

2.4術后TUNEL法測胰島β細胞凋亡率 RYGB組大鼠胰島細胞凋亡率術后4 w為(4.01±0.39)%，明顯低于同時間SRYGB組〔17.94±0.53)%，P＜0.05〕。C組胰島細胞凋亡率為(3.56±0.36)%。見圖1。

2.5術后免疫組化檢測凋亡蛋白β-catenin、caspase-12的表達術后4 w β-catenin陽性表達率在RYGB組、S-RYGB組和C組分別為78.5%、30.8%和60.0%;RYGB組與S-RYGB組比較有差異(P=0.021)，與C組比較無差異(P=0.427)。術后4 w caspase-12陽性表達率在RYGB組、S-RYGB組和C組的分別為35.7%、84.6%和33.3%;RYGB組與S-RYGB組比較有差異(P=0.018)，與C組比較無差異(P=1.000)。見圖2、圖3。

表1 三組大鼠體重的比較(s)

表1 三組大鼠體重的比較(s)

與同時間點S-RYGB組比較:1)P＜0.05;與同時間點C組比較:2)P＜0.05

組別 n 體重(g)空腹血糖(mmol/L)4 w RYGB組 14 277.5±15.9 240.4±12.9229.5±10.51)2)235.0±14.31)2)238.0±16.61)2)17.6±0.6 11.5±1.4 6.3±0.8 5.5±0.7 3.9±0.71)術前 術后1 w 術后2 w 術后3 w 術后4 w 術前 術后1 w 術后2 w 術后3 w 術后S-RYGB組 13 273.3±20.8 258.9±14.9 272.9±15.1 286.9±18.6 304.3±25.6 17.5±0.7 15.6±0.8 15.3±0.7 15.4±0.8 15.5±1.0 C組 15 274.5±17.8 265.5±13.2 280.0±22.8 310.8±24.4 325.0±15.8 3.7±0.4 3.5±0.3 3.7±0.2 3.6±0.3 3.5±0.4 P值 0.771 0.111 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 術后胰島TUNEL染色結果(×400)

圖2 胰島β細胞β-catenin蛋白免疫組化結果(DAB，×400)

圖3 胰島β細胞caspase-12蛋白免疫組化結果(DAB，×400)

3討論

在2型糖尿病的發病過程中胰島β細胞功能受損起著重要的作用〔4〕。造成胰島β細胞功能受損的眾多因素中，細胞凋亡是胰島β細胞功能減低的主要因素之一。傳統治療只能單純控制血糖，對減緩胰島細胞凋亡作用不顯著，而RYGB不僅能夠迅速降低體重，長期控制血糖，而且能減少胰島細胞凋亡，但具體的機制尚不清楚〔5〕。

β-catenin是wnt通路里的關鍵蛋白，其表達上升可引起增殖相關基因(如TCF/LEF)表達上調促進細胞增殖〔6〕。在細胞質中β-catenin與Axin、GSK3和APC等結合成無活性復合體，當wnt通路激活時，復合體解體，β-catenin不能被磷酸化而分解，從而進入細胞核引起核表達促使細胞發生增殖〔7〕。有文獻〔8〕指出胰島內wnt/β-catenin信號通路在調節血糖以及能量平衡起著重要作用。敲除β-catenin基因的胰腺中，β細胞數量銳減，糖耐量立刻損壞引起高糖，而高糖又可以抑制wnt信號的表達，下調核轉錄因子β-catenin，同時促發caspase活化以增加細胞凋亡〔9〕;且RYGB干預后，糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡率可能恢復到正常胰島凋亡水平。

caspase-12是ER應激標志性分子，介導非依賴性線粒體的細胞凋亡。活化的caspase-12可以直接通過細胞色素C非依賴途徑引起細胞凋亡〔10〕，因此其可以作為檢測細胞凋亡的一個很好的蛋白。caspase-12和ER應激有關，而肥胖、高糖及胰島細胞過度分泌使胰島β細胞內ER過度負荷，引起細胞凋亡〔11〕。國外相關實驗證實通過胃旁路術可以緩解內質網應激，改善胰島細胞生成環境，減少胰島細胞凋亡〔12〕。通過實驗我們觀察到在糖尿病陽性對照組的大鼠維持較高血糖的同時胰島細胞胞質里存在大量的caspase-12蛋白，且胰島細胞凋亡增多;相反的情況出現在糖尿病RYGB手術組和C組里。由此我們推測RYGB通過減輕ER應激，調節caspase-12表達來參與胰島β細胞凋亡，并有效的控制血糖。

本實驗血液生化學檢查和病理形態結果表明，RYGB能夠顯著降低糖尿病大鼠的血糖，并能夠改善胰島功能，減少胰島凋亡，對胰島起到保護作用。wnt/β-catenin通路和caspase-12在分別參與胰島細胞凋亡的同時，它們之間也可能存在一些因子進行二者相互的動態調節。wnt/β-catenin和caspase-12的關系及其參與胰島凋亡的具體機制還需深入研究。

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