轉化生長因子-β1對巨噬細胞內膽固醇酯水解酶表達的影響

張鳳香 關 寧 李晨光 羅俊生 (遼寧醫學院附屬第一醫院心外科，遼寧 錦州 121001)

轉化生長因子(TGF)-β是由許多具有相同生物學特性的信號分子共同組成的一個大家族。研究發現，TGF-β1在巨噬細胞和T細胞等多種細胞中均有表達，并參與動脈粥樣硬化(AS)的形成和狹窄等過程〔1〕。膽固醇酯水解酶(CEH)是一種催化酶，它在動AS過程中起重要作用，它能催化膽固醇酯(CEs)水解為游離膽固醇(FC)，從而促進膽固醇外流，減少CEs在細胞內的蓄積，維持細胞內脂質的穩定，抑制單核巨噬細胞的泡沫化〔2〕。本實驗通過Ad-TGF-β1作用于巨噬細胞，觀察其是否對巨噬細胞CEH表達產生影響，進而探討二者在AS過程中的作用。

1 材料和方法

1.1材料 THP-1人單核巨噬細胞購自中國科學院上海生物研究所細胞庫;胎牛血清、胰蛋白酶購自碧云天公司;兔抗鼠CEH單克隆體、兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、PCR試劑盒、HRP標記山羊抗小鼠二抗均購自北京中杉金橋公司;小鼠CEH酶聯免疫(ELISA)試劑盒購自晶美公司;人源重組腺病毒載體Ad-TGF-β1購自Gibco公司。

1.2細胞培養和分組 THP-1人單核巨噬細胞于6孔板內培養24 h，去除未貼壁細胞后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱內培養。每24～48 h傳代一次。在培養的巨噬細胞加入5 ng/ml人源重組腺病毒載體Ad-TGF-β1分別刺激24、48、72 h，隨后收集細胞。

1.3RT-PCR檢測TGF-β1和 CEH的表達 收集并計數各組細胞，按5×106個細胞加1 ml RNAiso Plus提取細胞總RNA，經紫外分光光度計檢測RNA濃度，參照反轉錄試劑盒說明書進行發轉錄反應。反轉錄PCR法檢測表達。CEH的上游引物為:5'-GCATCCGGATCCACCCAGAA-3'，下 游 引 物 為:5'-GAAAGAGTCAAAGATGGTGCCAGA-3'。TGF-β1 上游引物為:5'-CTGCTCACCCAACATTTCGT-3'，下游引物為:5'-GTGGTTTGTCCAAACTCATCAA-3'。內參β-actin的上游引物為:5'-ACCCTGAAGTACCCCATCG-3'，下游引物為:5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。擴增條件為:95℃ 30 s;94℃ 5 s，61℃ 30 s，共30個循環。

1.4Western印跡法檢測TGF-β1和CEH的表達 收集各組細胞以冷PBS清洗2次，以裂解緩沖液提取總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經濃縮膠為6%、分離膠為10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。通過電轉儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。與1∶1 000兔抗鼠CEH單克隆抗體、1∶300兔抗鼠CEH單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠IgG(1∶200)，4℃孵育2 h。洗膜3次后用化學發光底物顯影，凝膠成像。

1.5ELISA法檢測CEH的分泌情況 按每孔2×105個細胞接種于24孔板中，加入處理因素，分別培養24、48、72 h。收集細胞培養上清液。從平衡至室溫的密封袋中取出實驗所需板條，留空白孔。加0.1 ml離心后的細胞培養上清液于反應孔中，置37℃孵育90 min。然后洗板5次。于各反應孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1 ml，37℃孵育1 h，洗板5次。加酶結合工作液0.1 ml，37℃避光孵育30 min，洗板5次。加入0.1 ml顯色底物液，37℃避光孵育15 min:于各反應孔中加入終止液0.1 ml，混勻后即可測量OD450值。

1.6統計學方法 采用SPSS13.0軟件，行ANOVA分析。

2結果

2.1PT-PCR檢測Ad-TGF-β1刺激的巨噬細胞CEH的表達隨著Ad-TGF-β1作用時間的延長TGF-β1的mRNA表達水平明顯增強(24、48、72 h分別為 25.21 ±1.04，61.96 ±1.46，99.34±2.45);同時CEH的mRNA表達水平也隨之明顯增強(24、48、72 h分別為 19.2 ±1.17，53.53 ±1.78，82.17 ±2.01，圖1)。

圖1 RT-PCR檢測Ad-TGF-β1對巨噬細胞中CEH和TGF-β1 mRNA表達的影響

2.2Western印跡法檢測Ad-TGF-β1刺激的巨噬細胞CEH的表達 Western印跡法檢測結果發現，72 h組高于48 h組，48 h組又高于24 h組，呈現明顯的時間依賴關系，即隨著Ad-TGF-β1作用時間的延長TGF-β1的蛋白表達水平明顯增強;同時CEH的蛋白表達水平也隨之被明顯增強(P＜0.05)，見圖2，表1。

2.3ELISA法檢測Ad-TGF-β1刺激的巨噬細胞CEH的分泌情況 Ad-TGF-β1刺激的巨噬細胞上清液中CEH的含量變化趨勢與前述研究結果相似，72 h組CEH含量最高隨著Ad-TGF-β1作用時間的延長巨噬細胞上清液CEH的含量明顯增強(P＜0.05)。見表1。

圖2 Western印跡檢測Ad-TGF-β1對巨噬細胞中CEH和TGF-β1蛋白表達的影響

表1 Ad-TGF-β1 對巨噬細胞中 CEH、TGF-β1表達的影響(x ± s，n=6)

3討論

AS是缺血性腦血管病的主要病理基礎，而單核巨噬細胞是動脈粥樣硬化形成的重要效應細胞。巨噬細胞可以通過吞噬血管內皮下大量脂質形成泡沫細胞構成斑塊脂質核心，而當泡沫細胞發生壞死時可以釋放膽固醇酯(CEs)，CEs可以在血管壁損傷處大量聚集形成了AS壞死核心，直接引起蜂窩狀易碎斑塊的形成〔3，4〕。

CEH是一種催化CEs水解為FC的酶，它可以在巨噬細胞中表達，減少CEs在巨噬細胞內的蓄積，從而降AS的形成。研究發現［5〕CEH的表達水平同AS的易感性呈負相關，抑制CEH的表達可以明顯降低形成AS的風險。

TGF-β1在巨噬細胞內可以大量表達，它不但具有多種生物學功能，還在AS斑塊的發生發展中起重要作用〔6〕。臨床研究表明在AS性血管病變中，巨噬細胞內的膽固醇酯的水平和泡沫細胞的形成與單核、巨噬細胞中的TGF-β1濃度呈負相關〔7〕。上述我們得知，CEH和TGF-β1均能在巨噬細胞中表達，并通過表達的變化來影響AS的形成，但CEH和TGF-β1之間是否存在聯系尚不得而知。

本實驗結果發現，隨著Ad-TGF-β1作用時間的延長，CEH的表達水平也隨之被明顯增強，呈現明顯的時間依賴關系，說明可以通過增強TGF-β1的表達來提高CEH的表達。接下來又通過ELISA法檢測Ad-TGF-β1刺激的巨噬細胞CEH的分泌情況，結果發現，隨著Ad-TGF-β1作用時間的延長巨噬細胞上清液CEH的含量明顯增強，說明可以通過提高TGF-β1的表達來影響CEH的分泌情況。

綜上，本研究結果顯示提高TGF-β1的表達可以增強巨噬細胞內CEH的表達，但其在AS形成過程中的作用還需進行更深一步的研究。

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4 Zhao B，Song J，Stclair RW，et al.Stable over-expression of human macrophage cholesteryl ester hydrolase results in enhanced free cholesterol efflux from human THP1 macrophages〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，2007;292(9):405-12.

5 Rothblat GH，Dela LM，Favari E，et al.Cellular cholesterol fluxstudies:method ological considerations〔J〕.Atherosclerosis，2002;163(1):1-8.

6 Oram JF，Lawn RM，Abca FE，et al.The gatekeeper for elimiating excess tissue cholesreol〔J〕.Lipid Res，2011;42(8):1173-9.

7 Erren M ，Reinecke H ，Junker R，et al.Systemic inflammatary parameters in patients with atherosclerosis of the coronary and peripheral arteris〔J〕.Artorisclor Thromb Vasc Biol，1999;19(3):2355-63.