乳兔單一左心房肌細胞原代培養及鑒定

鄭甲林 郭 濤 張新金 陶四明 代華磊 韓明華 李建美

(昆明醫科大學第四附屬醫院心內科，云南 昆明 650021)

Harary等〔1〕首次嘗試Wistar乳鼠心肌細胞原代分離培養。然而，到目前為止研究心肌細胞培養方法更多集中在心室肌細胞培養或心室肌與心房肌細胞混合培養，且多選擇乳鼠作為研究對象。關于單一心房肌細胞的培養研究相對較少，局限于左心房的心肌細胞培養實驗未見報道。本文對以往心肌細胞培養方法學習總結，成功分離、純化、培養并鑒定出了乳兔單一左心房肌細胞。

1 材料與方法

1.1動物、試劑、實驗設備 日本大耳乳兔，出生48 h內，雌雄不限，由昆明醫科大學動物實驗室中心提供。胎牛血清(Hyclone公司)，高糖型DMEM培養基(Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS、自配)，胰蛋白酶(Difco)，Ⅱ型膠原酶(Invitrogen)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Sigma公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100、Amresco)，組織固定液(多聚甲醛，Sigma)，封閉專用脫脂奶粉(BSA、北京 Applygen公司)，0.4%臺盼藍(Trypan Blue，Sigma公司)，一抗為α-橫紋肌肌動蛋白抗體小鼠抗兔(α-Sarcomeric actin Antibody，Santa Cruz公司)，二抗為羊抗小鼠IgG-FITC熒光標記及羊抗小鼠IgG-Cy3熒光標記(武漢博士德生物有限公司);4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司);青鏈霉素雙抗(hyclone公司);其他試劑均為國產分析純;細胞培養皿、培養瓶、培養板(美國BD Falcon);恒溫二氧化碳培養箱(美國 New Brunswick Scientific Innova CO-170 CO2incubator);生物安全柜(美國Thermo Electron Corporation forma classⅡA2);倒置顯微鏡(日本Olympus IX51);離心機(中國京立LDZ5-2);恒溫磁力攪拌器(韓國WiseStir MSH-20D);恒溫振蕩水浴箱(北京恒久科學儀器廠)。

1.2乳兔左心房肌細胞培養及純化 借鑒Bénardeau等〔2〕心房肌細胞培養方法并加以改良。同時取10只出生48 h內的日本大耳乳兔，斷頸處死，75%酒精全身消毒后，在生物安全柜內，消毒眼科剪剪開胸骨，迅速剪下心臟并置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中多次清洗、去血，用眼科剪在手術用放大鏡下仔細剪下左心房(含房間隔)，再次用PBS液多次清洗、去血致組織塊變白，在PBS液中用眼科剪將左心房及房間隔剪成直徑約1 mm3大小的組織塊。用吸管將1 mm3的組織塊轉移至離心管中，加入0.1%胰酶，37℃水浴10 min，反復輕柔吹打，棄上清液。將組織塊液全部轉移至直徑為6 cm的培養皿中，再加入預配0.1%胰酶、0.1%Ⅱ型膠原酶混合酶液5 ml，將組織塊盡量吹分散，培養皿中放入預先消毒的磁力攪拌子，將培養皿放在磁力攪拌器上，剩余組織再加入0.1%胰酶、0.1%Ⅱ型膠原酶混合酶液5 ml，將培養皿放在磁力攪拌器上，參數設置同上，重復消化，并留取上清液，直至組織塊完全消化。每次吸取的上清液加入容積為10 ml離心管中，再加入等體積的杜爾伯科改良伊格爾(DMEM)培養基(含10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗)終止消化。收集所有的組織消化液離心，800 r/min，5 min，用吸管小心吸取上清液棄之，沉淀的細胞加入適量DMEM培養基，用吸管反復輕柔吹打，制成細胞懸液。在細胞懸液中加入1滴無菌的1 mg/ml溶于水的DNA酶，防止消化的細胞粘連成團塊。用200目消毒不銹鋼網過濾細胞懸液，將細胞懸液接種于直徑為6 cm的培養皿中，培養皿置入恒溫二氧化碳培養箱(5%CO2、37℃)中培養60 min后，平穩取出培養皿，用吸管小心吸取培養皿中的細胞懸液轉移至另一培養皿中，用2次差速貼壁法去除成纖維細胞。調整細胞懸液為1×105個/ml，再將細胞懸液轉移至培養瓶中(培養瓶面積25 cm2)。最初的2 d在培養瓶中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)抑制非心肌細胞(成纖維細胞)生長，每1 ml培養基中加入10 mmol/L的5-BrdU 10 μl即得到5-BrdU終濃度0.1 mmol/L。置入恒溫二氧化碳培養箱中培養，以后每2天換培養基一次。

細胞傳代方法:單層細胞貼壁鋪滿培養瓶底的80% ～90%時進行傳代。用吸管小心吸取原代細胞瓶內的培養液棄之，加入PBS反復輕柔清洗細胞，棄PBS后加0.1%胰酶2 ml，鏡下觀察。當細胞由片狀收縮呈球形時，迅速加入DMEM培養基終止消化。用吸管反復吹打瓶壁，使細胞與瓶壁分離脫落，以1∶2分裝接種。細胞接近長滿瓶底后(約4～6 d)可再傳代，取第3代細胞進行鑒定與實驗。

細胞爬片制備:將第2代鋪滿培養瓶底的細胞同上步驟，制成細胞懸液滴加在放置有蓋玻片的6孔培養板中，每孔加樣3 ml，置入恒溫二氧化碳培養箱(5%CO2、37℃)中培養，以后每2天換培養基一次。

1.3心房肌細胞生長、形態觀察 每次消化后取0.5 ml細胞懸液于直徑3.5 cm的培養皿中，在倒置顯微鏡(200倍)下觀察心房肌細胞貼壁情況、生長狀況、形態學變化、細胞搏動時間及頻率，并照相。并從培養24 h至第7天，鏡下計數細胞搏動頻率(次/min)。

1.4酶消化后細胞存活率計算 經酶消化后，細胞接種前計數存活率。取吹打均勻的細胞懸液2 ml，與0.4%臺盼藍液5 ml、PBS液3 ml混合吹打均勻制成細胞懸液，于室溫下靜置5 min，使其充分染色，吸取少量混合細胞懸液于倒置顯微鏡下觀察，鑒定消化后的細胞存活率。正常細胞不被染色，顯微鏡下為透明、折光性強的圓形細胞，死亡細胞被染成藍色。在顯微鏡(200倍)下計數4個大格中的細胞總數及著色細胞數，每次計數3次，求平均值，重復3次。細胞成活率(%)=〔(總細胞數－著色細胞數)/總細胞數×100%〕。

1.5繪制細胞生長曲線 采用計數法繪制細胞生長曲線(計數方法同上)。選擇生長良好且接近融合的第2代細胞，經胰酶消化，用上述相同方法在新的培養基上制成細胞懸液。接種于24孔培養板內，每孔5×104個/ml做傳代培養，共接種21孔細胞。置入恒溫二氧化碳培養箱(5%CO2、37℃)中培養。24 h后開始計算細胞個數，之后每隔24 h計數一次，連續計數7 d，每次取3孔細胞分別計數，計算平均值。分別以時間(d)、單位細胞數(細胞個數/ml)為橫、縱坐標繪制細胞生長曲線，并計算細胞群體的倍增時間(Td)，Td=t×lg2/1gNt－lgNo，其中 t代表計數間隔時間或稱培養時間，No代表接種后的細胞數，Nt代表對數生長期任一點的理論觀察值(即培養t h后的細胞數)。

1.6心房肌細胞免疫熒光及純度鑒定 采用間接免疫熒光鑒定法。培養48 h后取出細胞爬片，PBS洗滌3次，5 min/次;用4%的多聚甲醛，室溫下固定30 min，PBS洗滌3次，5 min/次;細胞爬片上加0.5%TritonX-100對細胞進行打孔5 min，吸去打孔通透液，PBS洗滌3次，5 min/次;0.1%BSA室溫封閉30 min，加一抗小鼠抗兔α-橫紋肌肌動蛋白抗體(1∶50稀釋)4℃ 過夜;PBS洗滌3次，5 min/次;加二抗為羊抗小鼠 IgGFITC熒光標記及羊抗小鼠IgG-Cy3熒光標記(1∶100稀釋)，室溫90 min，PBS洗滌3次，5 min/次。加入抗熒光淬滅液封片。DAPI染色細胞核。熒光顯微鏡下觀察并照相，設立對照組(不加一抗，只加二抗)。于顯微鏡下(200倍)任選10個視野，計數陰性細胞數及細胞總數，計數3次，求平均值，陽性細胞率=細胞總數－陰性細胞數/細胞總數×100%。

2結果

2.1心房肌細胞鏡下觀察 每次消化后取0.5 ml細胞懸液于直徑3.5 cm的培養皿中，于倒置顯微鏡下觀察，可見心房肌細胞呈圓形或橢圓形。首次消化細胞量少，第2、3次消化細胞量較多，經3次后多可完全消化組織。收集所有的組織消化液經兩次差速貼壁后將細胞懸液接種于直徑為6 cm的培養皿中，倒置顯微鏡下可見單個細胞散在懸浮于培養基中，大多數細胞呈圓形或橢圓形;2～3 h后可見少量細胞貼壁，仍以圓形與橢圓形為主，可見少量細胞呈多邊形;接種16～24 h后細胞完全貼壁，細胞為長梭形、三角形、多邊形或不規則形，可見單個搏動細胞，頻率較慢;培養48 h部分細胞融合在一起;培養72 h細胞為多邊形、不規則形，大部分細胞間相互連接，搏動趨于同步;培養4 d后細胞達瓶底70%，相互連接在一起成簇，搏動基本同步，搏動頻率加快，50～101次/min;培養7 d后細胞達瓶底80%～90%或以上，偽足相互交織成網，融合呈同心圓放射狀排列，呈現同步搏動，心房肌細胞有一定收縮力。見圖1。

2.2肌細胞存活率 經臺盼藍染色，細胞計數板計數，測得細胞存活率平均為85.2%。其中實驗1次細胞存活率為81.3%，實驗2次為87.8%，3次為86.6%。

2.3心房肌細胞生長曲線 第3代心房肌細胞1～4×106/ml呈對數生長，倍增時間約24 h(見圖2)。

圖1 鏡下觀察心房肌細胞(×200)

2.4心房肌細胞純度鑒定 用特異性小鼠抗兔α-橫紋肌肌動蛋白抗體(一抗)、羊抗小鼠IgG-FITC熒光標記及羊抗小鼠IgG-Cy3熒光標記(二抗)心房肌細胞染色，陽性細胞質為綠色及紅色熒光，DAPI襯染細胞核為藍色熒光，進一步證實培養的細胞為心房肌細胞，陽性率達95%。見圖3。

圖2 第3代心房肌細胞生長曲線

圖3 心房肌細胞純度鑒定(×400)

3討論

目前原代心肌細胞培養的方法主要有酶消化法和組織塊培養法。組織塊培養法是將組織剪切成小塊后接種于細胞培養板、培養皿進行細胞分離培養，此方法操作簡單，但獲得的細胞數量少。酶消化培養法是將取下的組織剪碎后，在單獨胰酶或者膠原酶，或胰酶加膠原酶〔3，4〕的作用下去除細胞外基質使細胞游離。胰酶可分解細胞外基質中的蛋白質，同時對細胞膜有較強的破壞，組織細胞破壞作用很強，經胰酶消化后的組織會釋放大量的膠原蛋白，大量膠原蛋白易形成絮狀物，使消化后細胞和上清液很難分離開，影響心肌細胞分離;膠原酶可分解細胞外基質中膠原纖維，作用相對弱。此方法分離的細胞易于從培養基中獲取營養，可以快速獲得大量的細胞，培養細胞的效率高，較常用。

心臟細胞主要由心肌細胞和成纖維細胞組成，研究報道心肌細胞數占心臟細胞總數不一(30% ～60%)。培養出單一的心房肌細胞為進一步研究心房肌細胞基因轉錄、離子通道、蛋白表達改變，藥物干預及相關電生理變化提供平臺〔5〕，以及可進一步利用轉基因、膜片鉗等先進技術研究心臟疾病〔6，7〕。心房顫動(房顫)是一種最常見的發病機制復雜的心律失常疾病，房顫的發生與左心房病變聯系非常緊密，分離培養單一左心房肌細胞尤為重要。心房肌較心室肌薄，心房肌占整個心臟的比重很小，乳鼠、乳兔心臟體積很小，而心房體積則約1～2 mm3，取材很困難，再加上消化過程中酶損傷、機械損傷、非心房肌細胞干擾等因素，大大減少可獲得的細胞數量，給心房肌細胞培養帶來了困難。

哺乳動物心肌細胞在出生后的1 w具有部分分裂增殖能力，剛出生的心肌細胞增殖能力相對較強，本研究選用了出生48 h內的乳兔為實驗對象。胰酶及膠原酶用于原代細胞培養消化組織塊，濃度采用0.05% ～0.5%不等。消化時間偏長，胰酶對心肌細胞過度破壞，消化時間過短，膠原酶對細胞外膠原纖維降解不充分，不利于心肌細胞的游離;既保證將心肌細胞外基質分解破壞，又盡可能減少酶對心肌細胞的破壞。一般采用37℃水浴提高胰酶消化效率，也有為了防止胰酶對心肌細胞的過度破壞采用4℃過夜消化法〔8〕。本研究用較低濃度的胰酶和膠原酶混合酶(混合后濃度均為0.1%)消化心房肌組織。對同一次取材組織進行多次消化的方法，并對每一次提取的組織消化液及時終止消化，防止胰酶對心房肌細胞的過度破壞。被胰酶破壞的心房肌細胞釋放DNA，易引起細胞粘連成團塊，在組織消化液中加入少量無菌的1 mg/ml的DNA酶預防。吸管對組織塊吹打時盡量輕柔，以800 r/min對組織消化液離心，盡量減少對心房肌細胞的機械損傷。本研究發現經酶消化后細胞存活率為85.2%，可以進一步純化心房肌細胞。

本研究結果證實培養的心房肌細胞能較長時間內保持較高的活力。接種密度控制在1×105～5×105個/ml，接種密度過低造成細胞間的信號傳遞困難，不利于細胞生長及信號傳遞，接種過密細胞生長過早接觸抑制，營養不良，細胞生長及活力受限。

1 Harary I，Farley B.In vitro studies of single isolated beating heart cells〔J〕.Science，1960;131(3414):1674-5.

2 Bénardeau A，Hatem SN，Rücker-Martin C，et al.Primary culture of human atrial myocytes is associated with the appearance of structural and functional characteristics of immature myocardium〔J〕.J Mol Cell Cardiol，1997;29(5):1307-20.

3 Sreejit P，Kumar S，Verma RS.An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice〔J〕.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2008;44(3-4):45-50.

4 Golden HB，Gollapudi D，Gerilechaogetu F，et al.Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups〔J〕.Methods Mol Biol，2012;843:205-14.

5 Cerbai E，Sartiani L，De Paoli P，et al.Isolated cardiac cells for electropharmacological studies〔J〕.Pharmacol Res，2000;42(1):1-8.

6 Brand NJ，Lara-Pezzi E，Rosenthal N，et al.Analysis of cardiac myocyte biology in transgenic mice:a protocol for preparation of neonatal mouse cardiac myocyte cultures〔J〕.Methods Mol Biol，2010;633:113-24.

7 Louch WE，Sheehan KA，Wolska BM.Methods in cardiomyocyte isolation，culture，and gene transfer〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011;51(3):288-98.

8 陶 靜，馬依彤，李曉梅，等.原代乳鼠心肌細胞培養方法的改進〔J〕.中華心血管病雜志，2014;42(1):53-6.