藍莓花色苷對人臍靜脈內皮細胞凋亡調控基因Bax、Caspase-3表達的影響

林 歡 冷吉燕 于 靜 孟 霖 (吉林大學第一醫院干部病房，吉林 長春 130021)

藍莓花色苷是從藍莓果實中提取的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、清除自由基〔1〕、降血脂及對心血管系統保護作用〔2，3〕。隨著細胞培養和免疫組化技術的發展，黃酮類植物化合物在多種代謝性疾病，如動脈粥樣硬化(AS)、高血壓、糖尿病等的作用機制研究也越來越深入。本實驗擬利用觀察藍莓花色苷對血管緊張素(AngⅡ)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)凋亡及凋亡相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 HUVEC(吉林大學白求恩醫學院藥理學實驗室)、藍莓花色苷(本課題組先期提取，并已經鑒定)、DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美國Hyclone 公司);AngⅡ、二甲基亞砜(DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，美國Sigma公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2主要實驗器材 低溫高速離心機(美國Thermo公司)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、MCO-20AIC型二氧化碳培養箱(日本SANYO公司)、CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、流式細胞儀(美國BD公司)、細胞計數板(上海求精生化試劑儀器有限公司)、細胞培養板96孔板(美國Corning公司)。

1.3HUVEC的培養、傳代與鑒定 從液氮罐中取出裝有HUVEC的凍存管，放入37℃水浴箱中不斷搖晃，1 min內迅速解凍細胞懸液，隨即于超凈臺內移入無菌離心管，加入2 ml DMEM高糖培養液，吹打均勻后，1 000～1 200 r/min離3～5 min，棄上清后，再加入DMEM高糖培養液2 ml，吹打成細胞懸液，種入含10%FBS的DMEM高糖培養液的25 ml培養瓶內，置于37℃含5%CO2孵箱中培養，次日可見細胞貼壁生長，換液。3～5 d長滿瓶底90%，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，傳代后隔天換液，取對數生長期細胞為實驗對象。用Ⅷ因子相關抗原(SP免疫細胞化學染色法)檢測陽性鑒定為內皮細胞。

1.4實驗細胞分組及預處理 培養瓶中HUVEC生長至60%左右融合，換無血清培養液培養24 h，使細胞同步化，細胞分組處理:(1)空白對照組(Control):HUVEC用含10%FBS+DMEM高糖培養液培養。(2)AngⅡ組:HUVEC分別用10－9、10－8、10－7、10－6、10－5、10－4mol/L AngⅡ +10%FBS+DMEM高糖培養液培養。(3)藍莓花色苷組:HUVEC分別用80、40、20、10、5、2.5 μg/ml藍莓花色苷 +10%FBS+DMEM 高糖培養液培養。(4)AngⅡ+藍莓花色苷組:HUVEC在含有20 μg/ml藍莓花色苷的培養液中孵育2 h后，再加入10～6 mol/L AngⅡ，共同孵育24 h。上述各組細胞均置于5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養。

1.5培養細胞的活性鑒定 無菌條件下將細胞懸液按200 μl/孔接種于96孔培養板內。5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，吸去培養液。根據上述不同的實驗設計分組加藥，設不加細胞不加藥組為調零孔。培養一定時間后，采用MTT法檢測細胞活性。實驗至少重復3次。

1.6流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡率 (1)將傳代后HUVEC接種在培養瓶中，培養24 h;(2)換用DMEM高糖培養液(無血清)作用24 h，使細胞同步化;(3)按1.2.2實驗細胞分組及預處理后，繼續培養48 h;(4)0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化培養瓶中細胞，用冷的PBS洗滌細胞兩次;(5)加入400 μl的1×Binding buffer懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106個細胞/ml;(6)在細胞懸液中加入5 μl Annexin VFITC輕輕混勻，2℃ ～8℃避光孵育15 min;(7)加入10 μl的PI后輕輕混勻，2℃ ～8℃避光孵育5 min;(8)1 h內流式細胞儀檢測和分析細胞凋亡率。每組實驗重復3次。

1.7Western蛋白免疫印跡法檢測Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表達 (1)取空白對照組、AngⅡ組和AngⅡ+藍莓花色苷組細胞各一瓶，按各組實驗設計給藥24 h后，用PBS(最好是冷的)洗3遍，吸干，加300 μl RIPA裂解液于冰上或冰盒上反應5 min，用細胞刮刮培養瓶，用移液器分別收集到潔凈的EP管里，于管壁做好標記，置于已預冷至4℃離心機中反應30 min，3 000 r/min離心15 min，分別轉移上清液至新的EP管中，做好標記后13 000 r/min，離心10 min;(2)加入4×loading buffer，調蛋白濃度至 0.8 μg/μl，混勻后，加入巰基乙醇(1 ml裂解液中加入60 μl巰基乙醇);(3)用封口膜封好EP管，95℃以上煮沸10 min、90℃左右微沸5 min，冷卻后可放于－20℃冰箱保存備用。(4)蛋白濃度的測定嚴格按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書操作。結果以目的蛋白與GAPDH的OD比值表示。

1.8統計學方法 應用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1AngⅡ對HUVEC增殖的抑制作用 HUVEC用不同濃度的 AngⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)給藥 24 h 作用后，各濃度AngⅡ對HUVEC的增殖都有抑制作用，有一定的濃度依賴性，濃度≥10-6mol/L時對HUVEC的增殖抑制作用更加顯著，AngⅡ10-4mol/L時細胞增殖被抑制了44%;給藥48 h后，AngⅡ誘導組各濃度對HUVEC的增殖都有抑制作用，有明顯的劑量依賴性，與空白對照組比較，AngⅡ10-4mol/L時細胞的增殖被抑制了50%。因此，選取10-6mol/L作為AngⅡ最適實驗濃度。見表1。

2.2藍莓花色苷對HUVEC增殖的影響 見表2。給藥24 h后，低濃度藍莓花色苷可輕度增加HUVEC的增殖作用，呈濃度依賴性，當濃度≥40 μg/ml時對HUVEC的增殖出現抑制作用，也有一定的濃度依賴性，最高濃度使細胞增殖抑制了11%;給藥48 h后，藍莓花色苷濃度≥40 μg/ml時對HUVEC的增殖亦有抑制作用，與空白對照組比較，最高濃度時細胞的增殖被抑制了11%。因此，本實驗選取20 μg/ml作為藍莓花色苷的最適實驗濃度。

表1AngⅡ對HUVEC增殖的抑制作用(x ± s，n=7)

表2 藍莓花色苷對HUVEC增殖的影響(x ± s，n=7)

2.3藍莓花色苷對Bax、Caspase-3的影響 藍莓花色苷能夠降低Bax的表達，抑制Caspase-3的激活。見圖1。

圖1 藍莓花色苷對Bax、Caspase-3的影響

3討論

隨著對血管內皮細胞(VEC)生物功能的不斷認識探究，認為AS早期形成的始動環節是內皮細胞功能的阻礙〔4〕。VEC損傷參與粥樣斑塊的形成，同時可誘發血管收縮及形成血栓，因此，VEC的損傷和凋亡被認為是AS的觸發環節和早期最重要病變特征〔5〕。研究表明，AngⅡ可以通過增加血管內膜的通透性，激活核轉錄因子(NF)-κB，增加黏附分子、炎癥趨化因子以及細胞因子的表達，引起LDL的攝取和氧化，并誘導產生活性氧(ROS)，直接滅活NO，氧化低密度脂蛋白(LDL)，導致氧化應激等促進內皮細胞凋亡。本研究證明藍莓花色苷對細胞凋亡具有抑制作用;藍莓花色苷有抗氧化、保護VEC的功能，在AngⅡ誘導的內皮細胞凋亡中，氧化應激起著重要作用。綜上所述，本研究表明藍莓花色苷對HUVEC凋亡的抑制作用無論是細胞存活率方面，還是凋亡蛋白表達量方面都具有顯著變化，影響Bax、Caspase-3的表達、降低胞內ROS也是其抗凋亡機制之一，從而影響ROS-NF-κB-Caspase-3通路，發揮抑制細胞凋亡的作用。提示藍莓花色苷可能是重要的抗氧化藥物。

1 Seeram NP，Momin RA，Nair MG，et al.Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant cyanidin glycosides in cherries and berries〔J〕.Phytomedicine，2001;8(5):362-9.

2 Abidov M，Jimenez Del Rio M，Ramazanov A，et al.Efficiency of pharmacologically-active antioxidant phytomedicine Radical Fruits in treatment hypercholesteremia at men〔J〕.Georgian Med News，2006;140:78-83.

3 de Pascual-Teresa S，Moreno DA，García-Viguera C.Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health:a review of current evidence〔J〕.Int J Mol Sci，2010;11(4):1679-703.

4 孟娟娟.血管內皮細胞功能與動脈粥樣硬化的研究進展〔J〕.價值工程，2014;33(15):295-6.

5 Luscher TF.Vascular protection:current possibilities and future perspectives〔J〕.Int J Clin Pract，2001;117(Suppl):3-6.