葛根素對乳腺癌細胞MCF-7增殖及凋亡的影響

李馨剛 (北華大學附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132000)

研究表明，葛根素具有保護心血管系統(tǒng)、抗氧化、降血糖等功能〔1～3〕。李娟等〔4〕表明，葛根素可以抑制人小細胞肺癌細胞株H446的增殖;Yu等〔5〕的研究也證實，葛根素對結腸癌細胞株HT-29細胞增殖具有一定的抑制作用，而葛根素對乳腺癌細胞株MCF-7的作用未見報道。本研究采用葛根素處理人乳腺癌MCF-7細胞，觀察對其細胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與儀器

1.1材料 乳腺癌MCF-7細胞購于美國ATCC公司;葛根素(純度 ＞99%)購于中國藥品生物制品檢定所;RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胰蛋白酶、優(yōu)質胎牛血清購自美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)及Triton X-100購自美國Sigma公司;蛋白抽提-RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自碧云天生物科技公司;Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3單克隆抗體及內參還原型輔酶(GAPDH)購自美國Cell Sigaling Technology公司;二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京賽寶生物公司;其他試劑均為分析純。

1.2儀器 5417小型臺式冷凍離心機自德國Eppendorf公司;Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽自美國Bio-Rad公司;Multiskan Mk3酶標儀自Thermo公司;TS100型顯微鏡自日本Nikon公司;FACS CaliburTM流式細胞儀自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 嚴格遵循無菌原則，將已解凍的MCF-7細胞于含15%胎牛血清的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)(37℃、5%CO2飽和濕度)，每隔24 h更換培養(yǎng)基，鏡下觀察待達到80% ～90%融合，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，穩(wěn)定傳3～5代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3.2細胞增殖活性檢測 取對數生長期MCF-7細胞，以1×105/孔的密度接種培養(yǎng)板(96孔)，24 h后向培養(yǎng)基中加入葛根素，使終濃度依次為 0、20、50、100、200 μg/ml，其中以0 μmol/L為對照組，其余濃度則設為實驗組，常規(guī)條件(37℃、5%CO2飽和濕度)下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng) 24、48、72、96 h后向每孔加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，4 h后在492 nm波長下采用酶標儀讀取各組吸光值(A)，增殖抑制率(%)=(1－實驗組A/對照組A)×100%。同一觀察時間點每個濃度重復3次。

1.3.3細胞凋亡率及細胞周期檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡，PI單染流式細胞術檢測細胞周期。按1×106/孔的密度將MCF-7細胞接種培養(yǎng)板(6孔)，24 h后向培養(yǎng)基中加入葛根素使終濃度依次為0、20、50、100、200 μg/ml，常規(guī)條件(37℃、5%CO2飽和濕度)下培養(yǎng)，24 h 后收集細胞并行磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，根據Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，分別加入Annexin V/FITC和PI，染色15 min后上機測定凋亡率及細胞周期。

1.3.4凋亡指數檢測 向預先置入培養(yǎng)板底部的滅菌小玻片接種MCF-7單細胞懸液，鏡下觀察待細胞貼壁后，加入葛根素，使終濃度依次為 0、20、50、100、200 μg/ml，培養(yǎng) 48 h 后采用多聚甲醛固定細胞，PBS沖洗采用Hoechst 33258(5 μg/ml)，室溫下避光染色，30 min后于熒光顯微鏡下觀察，每個片子隨機選取5個高倍視野，凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3.5免疫印跡 收集 0、20、50、100、200 μg/ml葛根素處理48 h后的MCF-7細胞，1 000 r/min離心5 min后，向細胞沉淀中加入細胞裂解液，于冰上采用裂解后，測定蛋白濃度(BCA法)，每個樣本取定量蛋白，與上樣緩沖液混合后，常規(guī)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳和半干轉法轉膜，根據膜大小加入適量一抗，除Bax的稀釋比例為1∶100外，其余均為1∶200，4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后加入二抗(1∶3 000)，室溫2 h后行ECL顯色，采用Gel-Pro analyzer軟件分析各條帶光密度，以目的蛋白與GAPDH光密度的比值表示。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q法。

2結果

2.1不同濃度葛根素對MCF-7細胞增殖的影響 葛根素可抑制MCF-7細胞的增殖活性，除20 μg/ml葛根素作用24 h外，各濃度作用24、48、72、96 h后的增殖抑制率均高于0 μg/ml(P ＜0.05)，且 20、50、100、200 μg/ml組間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);總體上葛根素可呈劑量和時間依賴的方式提高增殖抑制率(P＜0.05)。見表1。

圖1 不同濃度葛根素對MCF-7細胞增殖抑制情況

2.2不同濃度葛根素對MCF-7細胞凋亡的影響 葛根素可提高 MCF-7 細胞的早期、晚期凋亡率，20、50、100、200 μg/ml的早期、晚期凋亡率均高于0 μg/ml(P＜0.05)，且各濃度組間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);同時，葛根素可提高MCF-7細胞的凋亡指數，隨葛根素濃度的增加，凋亡指數升高，且各濃度間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見表1。

表2 不同濃度葛根素對MCF-7細胞凋亡的影響(x ± s，%)

2.3不同濃度葛根素對MCF-7細胞周期的影響 葛根素可降低S期及G2/M期細胞比例，提高G0/G1期細胞比例，各濃度間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度葛根素對MCF-7細胞周期的影響(x ± s，%)

2.4不同濃度葛根素對凋亡相關基因表達的影響 葛根素可降低Bcl-2蛋白水平，且升高Bax和Cleaved caspase-3的蛋白水平，各濃度間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見表4。

表4 不同濃度葛根素對MCF-7細胞凋亡相關基因表達的影響(s)

表4 不同濃度葛根素對MCF-7細胞凋亡相關基因表達的影響(s)

濃度(μg/ml)Bcl-2 Bax Cleaved caspase-3 0 0.65±0.07 0.24±0.05 0.27±0.05 20 0.54±0.051) 0.31±0.061) 0.36±0.021)50 0.43±0.031)2) 0.44±0.041)2) 0.45±0.031)2)100 0.31±0.041)2)3)0.52±0.021)2)3)0.53±0.041)2)3)200 0.22±0.031)2)3)4)0.61±0.031)2)3)4)0.65±0.031)2)3)4)

3討論

惡性腫瘤嚴重威脅著人類生命和健康，其發(fā)病率和死亡率在許多國家和地區(qū)均高居首位〔6〕。腫瘤的化學治療同手術治療和放療一樣，已成為治療腫瘤的重要手段之一，然而目前使用的腫瘤化療藥物常伴有嚴重的副作用，如疼痛、嘔吐、脫發(fā)、進食困難等〔7〕。近年來，從傳統(tǒng)中藥中篩選抗腫瘤先導化合物及抗腫瘤活性成分逐漸成為人們關注的熱點。目前，來源于植物藥的抗癌制劑已超過總抗癌藥物的30%，其中紫杉醇、長春新堿和喜樹堿等已成為許多腫瘤治療的首選藥〔8〕。

本研究提示葛根素可抑制MCF-7細胞的增殖。細胞周期紊亂是癌細胞的基本特征，而抗癌效果或增敏劑一般通過影響細胞周期來發(fā)揮抗癌作用〔9〕。本研究亦發(fā)現葛根素可影響MCF-7的細胞周期，葛根素可將細胞阻滯在G0/G1期。除細胞過度增殖與細胞周期異常外，惡性腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡減少亦有關〔10〕。本研究結果發(fā)現，與未處理細胞相比，葛根素處理后的MCF-7細胞凋亡率、凋亡指數及凋亡促進基因的蛋白水平均上調，而凋亡抑制基因的表達下降，以上表明葛根素可促進MCF-7細胞的凋亡。該作用可能與提高凋亡促進蛋白表達、降低凋亡抑制蛋白表達有關。

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4 李 娟，胡永華.葛根素對人小細胞肺癌H446細胞周期和相關周期蛋白表達的影響〔J〕.中草藥，2008;39(10):1535-7.

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