依達拉奉對阿爾茨海默病大鼠行為學和核因子-κBp65及Caspase-3蛋白表達的影響

楊曉帆 安 寧 趙維娜 楊印東 陳 培

(牡丹江醫學院紅旗醫院神經內科，黑龍江 牡丹江 157011)

目前關于阿爾茨海默病(AD)的具體發病機制沒有定論，氧化應激及其凋亡機制已經引起神經病學專家廣泛關注，β淀粉樣多肽(Aβ)已被證實可作為構成AD特征性病變老年斑(SP)的核心成分〔1～6〕。依達拉奉(MCI-186)作為一種新的特異性較強的自由基清除劑，能夠利用強大的對·OH的清除能力，來阻止毒性羰基化合物的生成，發揮其抗氧化作用〔7〕。本研究探討MCI-186治療對AD大鼠行為學和核因子(NF)-κB p65及Caspase-3蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 Aβ25～35(北京博奧森生物技術有限公司生產);MCI-186(北京達科為生物技術有限公司，SIH-152-250MG);小牛血清清蛋白(美國，Sigma公司)，胰蛋白酶、D-Hanks液(美國，伯樂Bio-Rad公司);細胞培養基(DMEM)、乙二胺四乙酸(EDTA)(美國，Gibco公司)。

1.2動物處理 Wistar大鼠，雄性，3～4個月齡，體重200 g左右，自由飲水及攝食。首先給予水迷宮試驗，篩選活動正常者，隨機分為正常對照組(不給予任何處理)、假手術組(只鉆顱、不給予 Aβ1～40注射)、AD組(給予雙側海馬多點位注射Aβ1～40)、小劑量組(側腦室注射 MCI-186，0.2 μg/μl，10 μl)、中劑量組(0.5 μg/μl，10 μl)、大劑量組(0.8 μg/μl，10 μl)。每組30只。

1.3AD大鼠模型的建立 大鼠給予腹腔麻醉并固定，于雙側海馬(中線旁開2.2 mm、前囟點后1.4 mm)7個不同部位注射預先在 37℃ 恒溫箱中孵育 7 d的 Aβ1～40，每個位點注射3 nmol/d×7 d。在首次實驗時在背側丘腦前方顯微注射10 ng轉化生長因子β，以促進Aβ沉積。

1.4給藥方法 MCI-186組:癡呆模型制備7 d后開始側腦室注射，連續14 d。假手術組和AD組均于造模成功后給予注射生理鹽水10 μl。注射持續10 min左右，待完畢仍應緩停拔針2 min。正常對照組實驗結束給予注射亞甲藍溶液2 μl。

1.5行為學測定 采用Morris水迷宮法，進行定位航行實驗和空間探索實驗，分別與造模前、造模后第1～6天測定大鼠找到平臺所需時間(即逃避潛伏期)和2 min內跨越原平臺所在位置的次數，每日2次取平均成績。

1.6Caspase-3、NF-κB P65基因的mRNA表達的測定 按Trizol試劑盒說明提取總 RNA。利用 RT-PLR檢測 Caspase-3、NF-κB P65基因的 mRNA表達，用紫外分光光度儀測定A260 nm/A280 nm，比值1.9～2.0，計算RNA含量。引物設計參照文獻〔8〕:① NF-κB P65:正義鏈 3＇-GGACACATCGGTAACATAGA-5＇，反義鏈 3＇-CGTCTTTCTTCTGTAACTCC-5＇(擴增產物493 bp);②Caspase-3:正義鏈 3＇-GGTGACAGACAGAGTTATGG-5＇，反義鏈 3＇-CGTTTCTTTTGTCTAGGGTAC-5＇(擴增產物280 bp);③β-actin:正義鏈 3＇-ACATCTTTCACACCACGTTTA-5＇，反義鏈 3＇-GACTCTCCCTTTAGCACGCACT-5＇(擴增產物 380 bp，為內參照)。逆轉錄反應按試劑盒操作。RT-PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

1.7Caspase-3和NF-κB P65片段蛋白表達 常規提取細胞核蛋白，并利用Western印跡檢測Caspase-3活性片段和 NF-κB P65蛋白表達。

1.8統計學方法 采用統計軟件SPSS15.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2結果

2.1各組水迷宮實驗逃避潛伏期 與假手術組比較，AD組第1～6天逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05或P＜0.01);與AD組比較，小劑量組第4～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，中劑量組第2～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，大劑量組第2～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05或P＜0.01);與小劑量組比較，大劑量組第2～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

2.2各組水迷宮實驗2 min內跨越原平臺所在位置的次數與假手術組比較，AD組第1～6天跨越原平臺次數明顯減少(P＜0.05或P＜0.01);與AD組比較，小劑量組第4～6天跨越原平臺次數明顯減少(P＜0.05)，中劑量組第2～6天跨越原平臺次數明顯增加(P＜0.05)，大劑量組第2～6天跨越原平臺次數明顯增加(P＜0.05或P＜0.01);與小劑量組比較，大劑量組第2～6天跨越原平臺次數明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表1 各組水迷宮實驗潛伏期(s，x ± s，n=30)

表2 各組水迷宮實驗跨越原平臺次數(x ±s，n=30，次)

2.3各組Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達的測定 經不同劑量的MCI-186處理后，Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達降低明顯，且隨著劑量的增加，Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達降低更明顯，見圖1。

圖1 各組Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達

2.4各組Caspase-3和NF-κB P65蛋白表達的測定 經不同劑量的MCI-186處理后，Caspase-3和NF-κB P65蛋白條帶逐漸變細，且隨著劑量的增加，Caspase-3和NF-κB P65蛋白條帶逐漸變細更明顯。見圖2。

圖2 各組Caspase-3和NF-κB P65蛋白表達

3討論

AD發病機制較復雜，可能受遺傳、代謝及環境等眾多因素共同影響 。20世紀70年代，有學者提出了“膽堿能”假說〔9〕。隨著技術及相關研究的不斷深入，后續又有關于Aβ沉積、基因突變、炎性損傷、tau蛋白磷酸化過度、細胞內鈣穩態不平衡等學說的涌現〔10〕。近些年來，細胞凋亡、氧化應激和自由基毒性等對于AD發病的作用也日益引起學者的高度關注〔11，12〕。這些病理過程的發生、發展，在AD的致病過程中起著重要作用〔13〕。

Aβ是SP的核心成分，而SP是構成AD特征性病變的主要成分，Aβ的出現往往先于神經原纖維纏結(NFTs)的臨床表現及病理改變〔14〕。目前學術界一致同意，由Aβ所引發的神經毒性作用是導致AD發病的最終通路，參與AD的形成及其發展過程〔15〕。AD轉基因鼠及AD患者體外實驗均證實，Aβ沉積并引發淀粉樣斑塊后，往往會伴有活性氧(ROS)的出現，多光子成像技術也顯示，NF-κB受到活化，最終使得細胞內蛋白質及相關DNA受到損害，此時內源性抗氧化劑發揮神經保護作用已不能對抗ROS引起的神經退變。因此，通過自由基損傷引起Aβ 的神經毒性作用已經成為共識〔16，17〕。

MCI-186是由日本研制并于2001年上市針對自由基能夠進行有效清除的一種制劑，MCI-186利用對·OH的高效清除，可減少過氧化脂質的產生，避免腦細胞過氧化所造成的過度損傷〔18〕。動物實驗表明，MCI-186通過降低腦水腫的發生率，能夠達到恢復神經元缺失、降低或延緩遲發性神經元凋亡的作用目的，進而能夠有效阻止缺血性腦血管病的發生及進展。同時，其能夠在缺血再灌注的早期明顯改善缺血誘導的海馬齒狀回突觸長時程增強，提示MCI-186參與學習過程，并能能改善缺血患者的記憶能力。本文結果提示，MCI-186可提高AD大鼠空間學習記憶功能，其機制可能與提高大鼠腦組織抗氧化酶活性，減少自由基損傷及降壓作用有關。

Caspass-3作為Caspase家族成員較為重要蛋白酶的一員，其相關研究是Caspase家族成員中研究最深入的〔19〕。正常的機體狀態況下，Caspase是以非活化的酶原狀態存在，一旦被激活，便能迅速引發凋亡蛋白酶的級聯反應，最終出現細胞不可逆死亡。NF-κB作為具有多向轉錄及調節功效的蛋白質，能夠參與機體炎性反應及免疫應答等重要的生理及病理時期〔22〕。AD患者尸檢結果顯示神經變性過程中NF-κB活性增加。本研究提示MCI-186通過減輕大鼠DNA氧化損傷，加快DNA修復，改善動物腦血流情況，其機制可能與MCI-186可清除羥基自由基，并減少毒性羰基化合物水平有關。

綜上，MCI-186能夠提高AD大鼠空間學習記憶功能，降低NF-κBp65及Caspase-3 mRNA及蛋白的表達，促進細胞增殖，并能抑制細胞凋亡，從而達到保護神經細胞的目的，以0.8 μg/μl MCI-186效果更強。

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