Tween60和SDS強化白腐真菌修復DDT污染土壤

肖鵬飛，李玉文，KONDO Ryuichiro（.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 50040；.Faculty of Agriculture， Kyushu University， Fukuoka 8-858， Japan）

Tween60和SDS強化白腐真菌修復DDT污染土壤

肖鵬飛1*，李玉文1，KONDO Ryuichiro2（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.Faculty of Agriculture， Kyushu University， Fukuoka 812-8581， Japan）

為了提高DDT污染土壤的修復效果，研究了非離子表面活性劑Tween60及陰離子表面活性劑SDS在單一和組合兩種方式對人工污染黑土中白腐真菌Phlebia lindtneri GB1027降解去除DDT的強化作用.結果表明，Tween60和SDS均能不同程度地促進土壤中DDT的生物降解，尤其在兩種表面活性劑濃度為1.0mg/g干土時，土壤中DDT的降解率分別達到最高的62.9%和53.9%.相同濃度下，Tween60比SDS更有利于提高DDT污染土壤的生物修復效果，去除率提高接近10%.將Tween60與SDS以不同質量比例組合處理后的DDT去除率大小為:Tween60-SDS（3:1）＞Tween60-SDS（2:1）＞Tween60-SDS（1:1），尤其在質量比為3:1和2:1時的DDT去除率甚至高于Tween60單獨處理時的去除率，表明將兩種類型的表面活性劑組合后對提高DDT的生物可利用性產生了協同效果.研究還發現，菌株接種量越高，土壤中DDT的降解去除率越高，當接菌量達到1.0mL/g干土時，DDT的30d去除率達到最高的70.9%.在土壤含水率為10%～50%范圍內，白腐真菌對DDT的降解去除效果隨著土壤含水率的升高而增加，當土壤含水率達到50%時，土壤中有約70%的DDT被降解去除.本研究結果進一步證實了利用表面活性劑強化白腐真菌修復有機污染土壤的可行性.

DDT；表面活性劑；白腐真菌；生物降解；土壤修復

我國于20世紀80年代初停止了DDT的大規模生產和使用，但由于該化合物性質穩定，在自然界中難以分解，在我國土壤環境中仍有較高的殘留［1-2］.同時，為了履行《斯德哥爾摩公約》，我國關閉了大批DDT等有機氯農藥的生產企業，而企業原址在二次開發過程中，企業生產遺留下的污染場地的處理則成為了亟待解決的難題［3］.近十幾年來，國內陸續開展了對于污染土壤的修復研究，其中生物修復技術因其成本低、無二次污染、環境友好等特點，成為有機污染土壤修復的關鍵技術.目前DDT污染土壤的生物修復研究包括植物修復［4］、酶修復［5］、堆肥修復［6］及微生物修復［7］等.微生物的降解轉化是自然界有機污染物消除的重要途徑，也是有機污染物控制與修復的有效方法.白腐真菌作為能有效降解木素的絲狀真菌，降解酶特異性低，能降解多種難降解有機污染物.前期研究發現，白腐真菌及其酶系能在液相體系中高效降解DDT，顯示出一定的生物修復潛力［8］.然而，DDT疏水性強，一旦進入土壤，極易被土壤固相牢固吸附，從而限制了DDT的生物可利用性.可見，能否將DDT從土壤上解吸下來，增加其生物利用性，成為提高污染土壤生物修復效率的關鍵因素.而表面活性劑能利用產生的膠束提高疏水性有機物的水溶解度，并將其從土壤顆粒上洗脫下來，促進其向液相釋放. 如非離子表面活性劑Tween60和陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）已被報道用于DDT污染土壤的洗脫修復［9-10］及植物修復［11］的研究中，但鮮見其應用于強化污染土壤的微生物修復研究.如果將表面活性劑與白腐真菌共同處理污染土壤，可通過表面活性劑的增溶作用提高DDT的溶解性和生物可利用性，有望達到提高污染土壤生物修復效率的目標.

因此，本文針對國內對DDT等有機污染土壤修復技術的需求，在前期研究的基礎上，選擇已經證明對DDT具有較好洗脫效果的Tween60和SDS，考察其在單一和組合條件下對白腐真菌修復DDT污染黑土的強化效果，以及菌株接種量和土壤含水率對土壤修復效果的影響，探討將表面活性劑用于強化白腐真菌修復DDT污染土壤的可行性，為完善污染土壤的修復技術提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

供試土壤采自東北林業大學試驗林場，采用多點混合法采取0～15cm表層土壤，去除根莖、敗葉、碎石等雜物，混勻后于室內自然風干、研磨，過篩后備用.經測定，土壤樣品基本理化性質如下:有機質含量為37.4mg/g，pH值為6.5，黏粒、粉粒和砂粒所占比例分別為61.2%，33.3%和5.5%，陽離子交換量為28.6cmol/kg.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養 將在4℃斜面保存的白腐真菌Phlebia lindtneri GB1027接種于含有

15mLPDA固體培養基的平板培養皿中，30℃擴增培養5d，待長出的白色菌絲長滿整個PDA培養基表面，將菌絲體刮下接種到無菌水中，輕輕振蕩分散形成乳白色的孢子懸浮液并于4℃保存待用.取孢子懸浮液2mL接種于300mL的PDB液體培養基中，30℃、150r/min下活化培養.定期用平板計數法測定孢子數，達到106個/mL時即可進行降解試驗.

1.2.2 土壤修復試驗 稱取20g土壤裝入

200mL錐形瓶，經過高溫（121℃，60min）滅菌后在無菌室內用噴霧法加入一定量配制好的4，4'-DDT的二氯甲烷溶液，使各土壤樣品中DDT的濃度為60mg/kg，用無菌玻璃棒充分攪勻后制成人工模擬污染土壤.將錐形瓶置于通風櫥中間歇攪拌2周使溶劑風干，經二氯甲烷提取并測定各土壤處理中DDT濃度作為土壤初始DDT濃度.土壤中菌懸液接種量為0.6mL/g干土，并均勻添加3g滅菌木屑作為菌株生長的碳源和載體.將配制好的表面活性劑溶液均勻添加進錐形瓶.向錐形瓶通氧30s后密封，30℃條件下避光靜置培養30d，定時補充水分以保持土壤含水率一定.定時取樣測定土壤中DDT濃度.接種經過高溫滅菌處理（121℃、20min） 的菌懸液作為對照.實驗結束后將土壤風干，4℃保存，待測.每個處理做3個重復.

1.2.3 影響因素試驗 考察了各影響因素對土壤修復效率的影響，具體試驗方案設計如下:表面活性劑濃度為0，0.1，0.25，0.5，1.0和1.5mg/g干土；Tween60和SDS質量配比為3:1，2:1和1:1；菌株接種量為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mL/g干土；含水率為10%，20%，30%，40%和50%.

1.2.4 樣品處理與測定 將土壤樣品置于索氏提取器中，用200mL的二氯甲烷在恒溫水浴鍋上連續提取12h.將提取液在旋轉蒸發儀上濃縮至近干，加入10mL正己烷后濃縮至2mL左右.通過硅膠/氧化鋁層析柱進行分離凈化，層析柱規格為25cm ×1cm內徑的玻璃柱，柱上層加有無水硫酸鈉用以除水.樣品上柱后，依次用15mL正己烷和70mL二氯甲烷/正己烷（3:2，體積比）淋洗，將淋洗液混合后進一步濃縮，用氮吹儀定容至0.5mL左右.

采用HP6890-HP5973氣相色譜-質譜聯用儀對DDT進行定量測定.氣相色譜柱為DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）.載氣為高純氦氣，流量為1mL/min.進樣口溫度250℃，不分流進樣，進樣量1μL.升溫程序為:起始溫度80℃，保持2min后以15℃/min升至220℃，再以10℃/min升至300℃，保持2min.采用內標準法定量，DDT在實驗過程中的回收率為92.1%～99.0%.DDT的去除率%=（滅菌對照土壤中DDT的濃度-白腐真菌處理后土壤中DDT的濃度）×100/土壤中DDT的初始濃度.

2 結果與討論

2.1 Tween60對土壤中白腐真菌降解DDT的影響

考察了不同濃度的Tween60存在下白腐真菌對土壤中DDT的降解情況.在滅菌對照處理中，避光、封閉處理條件盡可能避免了DDT的光解、揮發等其它損失，DDT回收率為91.2%～99.6%.如圖1所示，在白腐真菌處理體系中，當沒有添加Tween60時，處理前10d去除率較低，僅為5.4%，從第10d開始去除率開始迅速增加，第30d時去除率已經達到了48.1%，可見菌株在土壤中對DDT具有一定的降解能力，但需要一段時期通過自身調整來適應土壤環境和污染物的脅迫.而在添加Tween60處理時，DDT的去除率隨處理濃度的不同而呈現出一定的差異.如在處理10d后，高濃度Tween60（0.5～1.5mg/g干土）存在時DDT的去除率顯著高于對照及低濃度Tween60（0.1和0.25mg/g干土）處理（P＜0.05）.在處理30d時，添加了濃度為0.1，0.25，0.5，1.0和1.5mg/g干土的Tween60的土壤中，DDT的去除率分別為52.9%，57.8%，62.0%，62.9%和62.1%，相比于未添加表面活性劑處理時的去除率分別提高了4.8%，9.7%，13.9%，14.8%和14.0%.該結果表明Tween60能促進土壤中DDT的生物降解率，且在一定濃度范圍內去除效果隨著Tween60濃度的提高而增加.

圖1 Tween60對土壤中DDT生物降解的影響Fig.1 Effect of Tween 60 on biodegradation of DDT in soil不同字母表示各處理間在0.05水平上的顯著差異，下同

在污染土壤的生物修復技術中，有機污染物的生物可利用性成為制約生物修復效率的關鍵因素之一.Tween60的臨界膠束濃度（CMC值）很低，在較低濃度時即可通過形成膠束提高DDT的溶解度，促使其從土壤顆粒上解吸下來［9］.章瑞英等［10］同樣發現Tween60可通過增溶作用將土壤中的DDT洗脫下來，且隨著Tween60質量濃度的逐漸升高，土壤中DDT的總洗脫效率逐漸增大.當DDT被Tween60從土壤中洗脫出來，其生物利用性和生物可降解性也必將隨之大幅增加，并通過白腐真菌降解而去除.Zheng等［12］利用非離子表面活性劑Tween80洗脫PAHs污染土壤后，利用白腐真菌降解洗脫液中的PAHs，去除率達到90%以上.此外，在一定的濃度范圍內，Tween60可作為白腐真菌生長所需碳源促進菌株的生長活性，從而提高降解菌的降解活性，這也是Tween60能促進土壤中DDT生物降解的原因之一［13］.但同時，高濃度的Tween60可能不利于該菌株的生長甚至產生毒性，從而導致去除率在濃度升至1.5mg/g干土時不但沒有進一步增加，反而略有下降.該結果表明土壤中添加1.0g/L左右的Tween60是有利于提高土壤修復效果的.

2.2 SDS對土壤中白腐真菌降解DDT的影響不同處理時間內，白腐真菌在含有不同濃度SDS土壤中對DDT的降解效果見圖2.在低濃度時，SDS對DDT生物降解的促進效果不明顯，如在濃度為0.1，0.25和0.5mg/g干土的SDS土壤溶液中，DDT的去除率與不添加SDS相比變化不大.而隨著SDS濃度的進一步升高至1.0mg/g干土時，土壤中DDT在20d后的去除率均顯著高于對照及低濃度處理（P＜0.05），30d去除率提高至最高的53.9%.這是由于SDS的濃度低于CMC值時，膠束尚未形成，絕大多數被土壤顆粒吸附的DDT仍然難以解吸下來，使得降解菌難以利用，因此對降解的促進效果也就不明顯.而當濃度增加至CMC值以上的1.0mg/g干土時，膠束開始形成并逐漸增加，致使DDT從土壤中開始解吸出來［9］，并被降解菌利用，此時去除率才開始呈現增加的趨勢.然而，同Tween60相似，隨著SDS濃度提高至1.5mg/g干土，去除率并沒有進一步增加，這可能是由于高濃度的SDS對菌株生長繁殖產生抑制作用所致.

圖2 SDS對土壤中DDT生物降解的影響Fig.2 Effect of SDS on biodegradation of DDT in soil

比較SDS與Tween60對白腐真菌修復DDT污染土壤的強化效果發現，相同濃度條件下，非離子表面活性劑Tween60要明顯好于陰離子表面活性劑SDS.這主要是由于兩表面活性劑在CMC值以及對DDT解吸能力的不同所致. Tween60的CMC值比SDS要低得多，具有更大的增溶容量，能將更多的DDT從土壤中解吸下來而被降解.還有研究表明，不同類型的表面活性劑被土壤吸附程度不同.被土壤強烈吸附的表面活性劑由于損失大，有效濃度越低，進而導致在強化土壤生物修復效率上呈現出差異［9］.

2.3 Tween60-SDS對土壤中白腐真菌降解DDT的影響

為了探索陰-非離子混合表面活性劑對白腐真菌修復DDT污染土壤的強化效果，本文研究了土壤修復體系中總濃度為1.0mg/g干土時的Tween60和SDS組合在不同質量配比處理下DDT的降解去除效果.如圖3所示，Tween60和SDS以不同質量配比后，各處理間的DDT降解去除效率呈現出一定的差異.尤其在處理20d后，Tween60和SDS的質量比在2:1以上時的DDT去除率開始呈現出顯著高于質量比為1:1時去除率的情況（P＜0.05）.以處理第30d為例，當Tween60和SDS的質量比為3:1，2:1和1:1時，DDT的去除率分別為67.4%，65.1%和57.1%，即呈現出隨著Tween60和SDS的質量比的增加，DDT去除率越高的趨勢.此外，比較表面活性劑在單獨和組合處理下DDT污染土壤的生物修復效果發現，當Tween60和SDS的質量比為3:1和 2:1時的去除率均要高于兩表面活性劑單獨處理；而二者質量比為1:1時的去除率低于Tween60單獨處理，但仍高于SDS單獨處理.從結果可見，將Tween60與SDS復配后可一定程度上改變白腐真菌對土壤中DDT的降解去除效果，在本研究中， 提高混合表面活性劑中Tween60的比例有利于DDT污染土壤的修復效果.

圖3 Tween60-SDS對土壤中DDT生物降解的影響Fig.3 Effect of Tween60-SDS on biodegradation of DDT in soil

有研究表明，當非離子表面活性劑和陰離子表面活性劑共存時可形成混合膠束和混合吸附層，減弱陰離子表面活性劑離子間的排斥作用，從而產生協同增溶的效果［14］.而且陰離子表面活性劑還能通過減少非離子表面活性劑單體的濃度，從而減輕土壤中非離子表面活性劑的吸附損失［15］.萬卷敏等［16］研究發現，在土壤中將SDS與Tween80混合后，二者吸附量均下降，尤其Tween80吸附量降低的幅度最大.據此推測，本研究中SDS在單獨存在時對DDT的降解去除效果雖然低于Tween60，但在表面活性劑共存體系中，一方面SDS的加入改善了Tween60被土壤顆粒的吸附損失，提高其在溶液中的有效濃度；另一方面，二者共存后通過協同增溶作用促進了DDT從土壤固相進入土壤液相，進而提高了DDT的生物可利用性和微生物降解效率.但需要指出的是，作為陰離子表面活性劑，SDS雖然可一定程度上提高土壤生物修復效果，但被指出具有一定的生物毒性，并能引起土壤質地結構的變化［17］，因此在大規模應用于土壤修復時需要注意.

2.4 接菌量對DDT污染土壤修復效率的影響

合適的投菌量可保證足夠的存活率和一定的種群水平，建立起降解菌數量上的優勢，對污染土壤起到快速、高效的修復效果.本文研究了在表面活性劑濃度為1.0mg/g干土時，不同接菌量條件下土壤中DDT降解情況，以考察白腐真菌接種量對土壤修復效率的影響.如圖4所示，在修復處理30d后，添加不同接種量的白腐真菌對土壤中DDT都具有一定的降解作用，但降解去除效果在各接菌量處理間差異顯著（P＜0.05）.在Tween60處理體系，接菌量為0.2和0.4mL/g時的去除率僅為27.1%和34.5%，而接菌量提高到0.8和1.0mL/g時，去除率達到64.1%和67.9%，顯著高于低接菌量時的去除率.在Tween60-SDS（3:1）混合處理中的DDT去除效果要略好于Tween60處理， 最低去除率出現在0.2mL/g接菌量時的29.1%，最高去除率出現在接菌量為1.0mL/g時的70.9%，而且高接菌量（≥0.6mL/g）時的去除率同樣顯著高于低接菌量（≤0.4mL/g）時的去除率，即DDT去除率隨著接菌量的增加而顯著增加.該結果表明適當提高接種量有利于降解菌的增殖，縮短延遲期，提高降解活性.

圖4 接菌量對土壤中DDT生物降解的影響Fig.4 Effect of inoculum amount on biodegradation of DDT in soil

從圖4還發現，當接菌量增至最大的1.0mL/g時，降解去除效果與接菌量為0.8mL/g時相比雖有增加，但并不顯著.原因可能是當接菌量達到一定程度時，菌體與底物已經充分接觸，此時接菌量已接近飽和，不再是制約DDT降解的主要因素［18］.若繼續投加降解菌可能會導致種間競爭，出現營養不足的現象，反而影響自身代謝過程及修復效率.因此，該試驗條件下白腐真菌接種量控制在0.8～1.0mL/g之間對于提高土壤修復效率是比較合適的.

2.5 土壤含水率對DDT污染土壤修復效率的影響

土壤水分通過改變土壤孔隙度、氧化還原電位、污染物溶解性及土壤吸附性等對土壤修復效率產生影響［19］.本文研究了在表面活性劑濃度為1.0mg/g干土，接菌量為0.6mL/g，不同土壤含水率條件下DDT的降解去除情況.如圖5所示，處理30d后，含水率不同的土壤中DDT去除率亦有顯著差異（P＜0.05），呈現出隨含水率的增加而顯著增加的趨勢.在Tween60處理體系中，土壤含水率為10%和20%時DDT的去除率僅為12.4%和21.1%，而隨著含水率上升至40%，去除率也快速提高至56.1%，當含水率達到50%時，去除率達到最高的69.2%.而在Tween60-SDS（3:1）處理中，含水率為10%時，去除率為最低的14.0%，在含水率為50%時的去除率最高，達到74.9%.該結果表明含水率會明顯影響白腐真菌對土壤中DDT的降解去除效率.土壤水分少，DDT被土壤顆粒吸附，降解菌難以利用；而土壤水分越多，表面活性劑生成的膠束就越多，從而加速DDT從土壤固相上的解吸，有利于DDT的生物降解.此外，土壤水分的增加同樣有利于降解菌的生長繁殖和酶活性的發揮［20］，進一步促進了對污染土壤中DDT的降解去除.

圖5 土壤含水率對DDT生物降解的影響Fig.5 Effect of moisture on biodegradation of DDT in soil

3 結論

3.1 在一定濃度范圍內，非離子表面活性劑Tween60和陰離子表面活性劑SDS通過對DDT的增溶解吸作用，可不同程度地促進白腐真菌P. lindtneri GB1027對土壤中DDT的降解，且去除率隨著表面活性劑濃度的升高而增加.相同濃度條件下，Tween60對土壤生物修復作用的強化效果要好于SDS.

3.2 將兩種類型的表面活性劑以不同質量比進行混合后，對DDT去除率的強化效果明顯區別于單一表面活性劑.不同處理間DDT去除率大小順序為:Tween60:SDS（3:1）＞Tween60:SDS（2:1）＞Tween60:SDS（1:1），即Tween60的比例越高，DDT降解去除效果越好，其中Tween60:SDS（3:1）和Tween60:SDS（2:1）處理中DDT去除率要高于Tween60單獨處理.

3.3 菌株接種量是制約土壤生物修復效果的主要因素之一.高接菌量可以保持降解菌數量上的優勢，縮短生物降解的延遲期，從而提高對DDT的降解活性.本研究中，接菌量為0.8和1.0mL/g干土時，對土壤中DDT的降解去除效果較好.

3.4 土壤含水率會顯著影響DDT污染的修復效率.土壤水分越多越有利于發揮表面活性劑的增溶和洗脫DDT的效果，提高DDT的生物利用性和去除率.在土壤含水率為10%～50%范圍內，DDT去除率隨著含水率的升高而顯著增加，土壤含水率為50%時DDT的去除率可達到70%左右.

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Enhancement of Tween60 and SDS for bioremediation of DDT-contaminated soil by white rot fungus.

XIAO Peng-fei1?，LI Yu-wen1， KONDO Ryuichiro2（1.College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China；2.Faculty of Agriculture， Kyushu University， Fukuoka 812-8581， Japan ）. China Environmental Science， 2015，35（12）：3737～3743

The effects of nonionic surfactant Tween60 and anionic surfactant SDS on bioremediation of DDT contaminated soils by white rot fungus Phlebia lindtneri GB1027 were investigated. The results showed that Tween 60 and SDS could enhance the degradation rate of DDT by fungus in soil， and the optimum concentration of both surfactants for fungal degradation of DDT was 1.0mg/g. P. lindtneri GB1027 showed the higher degradation activity of DDT from soil with Tween60than that with SDS. The efficiency of Tween60-SDS mixed surfactants for enhancing biodegradation capacity was as: Tween60-SDS （3:1）＞Tween60-SDS （2:1）＞Tween60-SDS （1:1）， and the enhancing capacity of Tween60-SDS （3:1） and Tween60-SDS （2:1） for fungal degradation of DDT from soil was higher than that of Tween 60. The inoculum amount could greatly enhance the removal rate of DDT from soil by P. lindtneri GB1027at a range of 0.2 to 1.0mL/g， and the highest degradation rate of DDT was 70.9% within 30days， when the inoculum amount of fungus was 1.0mL/g. It was also found that fungal degradation rates of DDT increased sharply with increasing soil moisture at a range between 10% and 50%， and that DDT of about 70% was removed from soil with moisture of 50% during 30 days of incubation. The above results confirmed the workability of white rot fungus-surfactants augmented remediation of DDT-contaminated soil.

DDT；surfactant；white rot fungus；biodegradation；soil remediation

X53

A

1000-6923（2015）12-3737-07

肖鵬飛（1978-），男，遼寧丹東人，講師，博士，主要從事污染土壤的修復技術研究.發表論文30余篇.

2015-04-29

中央高校基本科研業務費專項資金項目（DL13CB12）；國家自然科學基金項目（41201307）；日本農林水產省農產品安全項目（PO-3216）；人社部留學回國人員科技活動擇優資助項目

* 責任作者， 講師， xpfawd@nefu.edu.cn