典型生活垃圾填埋場覆蓋土微生物群落分析

何 芝，趙天濤，2*，邢志林，2，袁建華（.重慶理工大學化學化工學院，重慶 400054；2.重慶大學城市建設與環境工程學院，重慶 400030）

典型生活垃圾填埋場覆蓋土微生物群落分析

何 芝1，趙天濤1，2*，邢志林1，2，袁建華1（1.重慶理工大學化學化工學院，重慶 400054；2.重慶大學城市建設與環境工程學院，重慶 400030）

采用第二代高通量測序技術Illumina MiSeq對典型生活垃圾填埋場覆蓋土樣（山東萊蕪，SD；廣東深圳，GD；上海老港，SH；重慶長生橋，CQ）進行16S rDNA V3～V4區高通量測序，并分析了Alpha多樣性、物種組成和豐度、菌群結構及環境因子對群落結構的影響.結果表明:取自垃圾填埋場GD土樣的物種種類多于其他土樣，GD、SD、SH、CQ土樣的Shannon指數分別為5.52±0.026、4.76±0.030、4.89±0.037、3.43±0.027；所有覆蓋土樣的優勢菌為Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱），所占比例范圍分別為12.67%～25.54%，14.35%～18.88%；SD、GD和SH三種覆蓋土樣的優勢菌為Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌屬），分別占7.25%、10.67%、11.30%；Deltaproteobacteria（德耳塔變形桿菌綱）和Gammaproteobacteria（γ-變形菌桿綱）的相對豐度分別與TN（r=1.00，P＜0.001）和TP（r=1.00，P＜0.001）呈正相關關系，且結合RDA圖，TN、TP和OM含量可能是SD土樣區別于其他土樣群落組成的主要因素.

Illumina MiSeq測序；垃圾填埋場覆蓋土；微生物多樣性；群落結構；環境因子

垃圾填埋氣由200多種揮發性有機化合物組成，包括甲烷、二氧化碳、硫化氫以及痕量氣體如C2-C10烷烴、C2-C4烯烴、芳香族和鹵代烴類等有機化合物，排放于大氣中會造成臭氧層空洞、溫室效應等環境問題的加重.覆蓋土微生物經填埋氣長期馴化，對填埋氣中有毒有害物質具有較高的耐受性，并且具備了能夠降解烷烴、烯烴、芳香族等有害物質的能力［1］，極大地降低了填埋氣中污染物的濃度.Lakhouit等［2］模擬覆蓋土層對垃圾填埋氣中BTEX（苯、甲苯、乙苯、二甲苯同分異構體）揮發性有機物和OVOC （其他揮發性有機物）排放的影響，研究表明覆蓋層對BTEX和OVOC的降解效率范圍分別在67%～100%之間和96%～97%之間.張云茹等［3］對覆蓋土中甲烷氧化菌氯代烴降解能力進行研究，結果表明三氯乙烯初始濃度為15.64μmol/L，反應時間為5d時，甲基孢囊菌Methylocystis sp. JTC3對TCE的降解率為93.79%.

微生物的群落結構及多樣性是微生物生態學和環境科學研究的重點內容，對于開發生物資源，闡明微生物群落與其生境的關系，揭示群落結構與功能的聯系，從而指導微生物群落結構功能的定向調控具有重要價值.由于覆蓋土中絕大多數的微生物是不可培養或非活性狀態存在，采用傳統培養分離方法并不能代表該生境內真正的微生物多樣性.而熒光原位雜交（FISH）、末端限制性酶切片段長度多態性分析（T-RFLP）、變形梯度凝膠電泳（DGGE）、基因芯片技術等［4］分子生物學技術雖能夠繞開分離和培養，但受到樣品大小、采集等因素的影響，且許多微生物需在分離培養后才能透徹的對其研究，進而阻礙了覆蓋土微生物群落結構及多樣性的研究［5］.近年來，以測序通量高、成本低、定量準為特點的高通量測序技術（如Roche 454測序技術、IIumina的MiSeq和HiSeq測序技術）的出現，使得微生物多樣性及群落結構的研究更深入、更全面.Kim等［6］模擬垃圾填埋場覆蓋層甲烷降解，通過基于DNA和RNA的核糖體標簽焦磷酸測序對細菌群落進行分析研究，研究表明甲烷氧化菌活躍區域RNA占80%，而DNA占20%.大部分研究利用分子生態學方法（FISH、T-RFLP等）對垃圾填埋場覆蓋土微生物進行研究.Su等［7］研究了甲烷和甲苯、甲烷、甲苯3種體系對垃圾填埋場覆蓋土甲烷氧化菌群落結構及活性的影響，研究表明在3種體系中Proteobacteria和Bacteroidetes為優勢菌，且甲烷和甲苯共代謝體系對甲烷氧化菌和甲苯降解細菌具有較大影響.多數關于填埋場覆蓋土的研究都是基于覆蓋土具有良好的甲烷生物氧化能力［8］，而忽視了其他微生物在污染降解中的作用，他們既可降解其他非甲烷有機污染物，同時也能通過共代謝等作用影響甲烷氧化菌的活性.此外，不同土壤因氮磷含量、酸堿度、有機質含量及水分含量等的不同，其微生物群落結構及多樣性具有一定差異.Zhang等［9］研究NH4+-N含量對覆蓋土中微生物甲烷菌的影響，研究表明NH4+-N含量的增加會促進Methylobacter的生長.Liu等［10］研究表明pH值是土壤微生物群落變化的因素之一，然而大部分未測量的變化因素還未被解釋到.據此，本文考察了國內華東、華南和西南地區的典型生活垃圾填埋場，基于不同地區垃圾填埋場覆蓋土理化性質的不同，對微生物群落結構及多樣性進行初步研究，分析細菌微生物群落結構在自然條件下覆蓋土層中的演變規律，了解理化性質與微生物群落組成之間的關系，為功能菌篩選及填埋場覆蓋層微生物降解優化工藝提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 垃圾填埋場描述

圖1 填埋場地理位置Fig.1 Location of study landfills

選取了4個國內規模較大、填埋較規范的衛生填埋場進行采樣分析，填埋場所處的地理位置不同、氣候環境各有差異，具有一定的地域代表性.4個生活垃圾填埋場的地理分布情況如圖1所示，山東萊蕪（36°02′N， 117°19′E）生活垃圾填埋場位于山東省中部，泰山東麓，占地面積為20×104m2，日處理量400t，使用期限超過20年［11］；廣東深圳（22°27′N， 113°46′E）下坪生活垃圾填埋場位于深圳市羅湖區和布吉鎮交接處，庫容量為46.93×106m3，使用期限可達30年以上［12］；上海南匯區（31°2′N， 121°4′E）老港生活垃圾填埋場占地面積為33.6×105m2，每天消納城市生活垃圾6000～8000t［13］；重慶南岸區（29°35′N， 106°33′E）長生橋生活垃圾填埋場，占地69.14×104m2，庫容12×106m3，使用期限超過20年［14］.

1.2 土樣的采集和處理

土樣的采集于2013年8月進行，均采集垃圾填埋場覆蓋層10cm以下的土壤.山東萊蕪、廣東深圳下坪、上海老港和重慶長生橋城市生活垃圾填埋場覆蓋土樣分別編號為SD、GD、SH、CQ.用網孔為2mm的篩子將廢物、石頭等物質濾去，留下粒徑較小的土樣.每種土樣取部分于50mL的離心管中，置于-20℃冰箱中以備DNA提取和土壤理化性質檢測.

1.3 土壤DNA提取

用Mobio PowerSoil? DNA Isolation Kit提取土壤樣品中微生物總基因組DNA.并利用Mobio PowerClean? DNA Clean-Up Kit完成對DNA的純化.純化后的DNA產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

1.4 PCR擴增

以部分純化后的DNA為擴增模板，用細菌16S rDNA V3～V4區通用引物（338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'及806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA聚合酶，使用ABI GeneAmp? 9700型PCR儀進行擴增.20μL PCR反應體系中包括各0.8μL的引物，10μL的DNA模板，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，0.4μL FastPfu聚合酶，4μL 5×PCR buffer.PCR擴增升溫程序為:94℃預變性5min；94℃變性35s、59℃退火30s、72℃延伸35s，30個循環，最后于72℃延伸5min，4℃保存.每個樣品3個重復，將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測.

1.5 上機測序

樣本定量、DNA序列修飾及驗證和混合文庫后，將其定量稀釋至4～5pmol/L后放于Illumina MiSeq測序儀中測序，使用合成測序法，測定長度2×250bp.

1.6 數據分析

1.6.1 原始數據處理與樣品序列數目統計 對16S rDNA高變區序列采用雙峰（pair-end）測序，測序區域為V3～V4區.首先將原數據進行質量控制，除去低質量序列（50個連續堿基平均質量值低于20）.利用Flash軟件對質量控制序列進行對應兩端序列的連接，將連接上的序列進行過濾（連續相同堿基＜10，最大錯配比率為0.2），最終獲得可分析的序列.

1.6.2 OTU列表生成 應用Qiime，在Usearch軟件平臺中使用uparse方法將序列按照彼此相似性為97%分歸為許多小組，一個小組為一個操作分類單元（OTU），從而得到OTU的代表序列.然后，使用uchime檢測PCR擴增中產生的嵌合體序列并從OTU中去除，再用usearch_global方法將優化序列map比對回OTU代表序列，最終得到OTU各樣品序列豐度統計表.

1.6.3 稀釋曲線及多樣性指數 根據獲得的OTU數據，并利用R軟件以個體數與物種數來構建稀釋曲線，以該曲線表明樣品的取樣深度.多樣性指數可以反映微生物群落的豐度和多樣性，其計算公式如下:

Chao-the chao1estimator:

式中:Schaol為估計的OTU數；Sobs為實際觀測到的OTU數；n1為只含有一條序列的OTU數目；n2為只含有兩條序列的OTU數目.

式中:ni為含有i條序列的OTU數目；Srare為含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數目；Sabund為多于“abund”條序列的OTU數目；abund為“OTU”閾值，默認為10.

Shannon-the Shannon index:

式中:Sobs為實際觀測到的OTU數目；ni為含有i條序列的OTU數目；N為所有的序列數.

Simpson-the Simpson index:

式中:Sobs為實際測量出的OTU數目； ni為含有i條序列的OTU數目；N為所有的序列數.

1.6.4 群落結構分析 對OTU列表中獲得的分類信息與豐度進行整理，在綱和屬分類水平下對各樣品進行物種豐度統計、聚類分析及RDA分析，可得到樣品中群落組成結構、相似性以及群落結構與環境因子的關系.其中RDA（基于線性模型）分析圖是一種基于對應發展的排序方法，將對應分析與多元回歸分析相結合，每一步計算均與環境因子進行回歸，又稱多元直接梯度分析，可以反映群落組成與環境因子之間的關系.

2 結果與討論

2.1 土壤理化性質

表1 土樣理化性質Table 1 Soil physical and chemical properties used for this study

土樣SD、GD、SH和CQ理化性質分析，如表1所示.TN含量范圍在0.7487～2.119g/kg之間，小于中國東北農田黑土TN含量范圍（0.99～4.25g/kg）［10］；TP含量范圍在0.3245～0.9626g/kg之間；有機質（OM）含量范圍在9.346～29.09g/kg之間；硝態氮（N-N）含量和銨態氮（N-N）含量范圍分別在10.03～45.2mg/kg和5.8～264.8mg/kg之間，顯著高于甘肅某地區森林土壤N-N含量和N-N含量，分別在0.62～5.89mg/kg和5.71～7.80mg/kg之間［15］；pH值變化范圍在6.87～7.82之間，且波動較小，高于桑椹根際土壤及黑土pH值范圍（5.00～6.60）［10，16］，說明覆蓋土微生物適于中性偏堿性環境.SD土樣中TN、TP、OM和N-N含量顯著高于其他土樣，而N-N含量明顯低于其他土樣.CQ土樣中TN、N-N和N-N含量顯著高于其他土樣，分別為2.1g/kg，45.1mg/kg，256.2mg/kg，是SH土樣的2.73倍、4.29倍、26.97倍.重慶（CQ）長生橋垃圾填埋場占用農田較多，且覆蓋土取自填埋場附近土壤，這可能是其TN、N-N和N-N含量較高的原因之一.而SH土樣中TN和TP含量分別為0.77g/kg和0.848g/kg，均低于我國標準TN和TP含量的一般水平（1g/kg），與先前關于上海垃圾填埋場覆蓋土理化性質的研究結果一致［17］.此外，從表中還可發現，土樣中N-N含量普遍高于N-N的含量，從前3個土樣的N--N和N-N含量可看出隨著N-N的增加兩種理化性質含量差值減少.這可能是土壤中N-N較高，從而促進了硝化過程，被硝化細菌吸收轉化為NN而積累下來［18］.

2.2 Alpha多樣性分析結果

利用MiSeq平臺對SD、GD、SH和CQ 4種樣品通過邊測序邊合成的方法進行高通量測序，其測序結果如表2所示.4種樣品分別獲得有效序列數為12956、15786、8618、21856，樣品的平均覆蓋率為98.92%，且稀釋曲線趨于平臺期，表明該測序效果理想.土壤中微生物種類豐富，4種樣品物種豐富度順序為GD＞SH＞SD＞CQ，表明GD土樣需更多序列來評估它的物種豐富度.CQ土樣測序序列數量明顯多于其他土樣，但其OTU豐度顯著低于其他樣品，這可能是由于重慶長生橋垃圾填埋場覆蓋土多為周邊黏土［19］，土壤中微生物種類較少.

表2 序列統計及多樣性指數Table 2 Sequence statistics and diversity index

2.3 群落結構組成分析

總土樣中共檢測到80多種綱分類水平上的微生物，如圖2a所示.在所考察的4種土樣中，Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱）均為優勢菌，所占比例范為分別為12.67%～25.54%，14.35%～18.88%，同時也是黑土中的優勢菌群，約占20%［10］. Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria是土壤中重要的2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA）降解菌群［20］，且參與了農業土壤中2，4-二氯苯酚的轉化［21］.據此，4個城市的填埋垃圾中可能含有大量的農藥和醫藥物質（含有大量MCPA），從而使2種微生物菌群豐度較高.而Gammaproteobacteria（γ-變形菌桿綱）為SD和SH土樣的優勢菌，所占比例分別為18.25%，11.91%，可能是因為SD和SH填埋垃圾中含有較多的油脂物質［22］.此外，圖2a中Actinobacteria（放線菌綱）為GD和SH土樣的優勢菌，所占比例約為16%；Sphingobacteria（鞘脂桿菌綱）為CQ土樣的優勢菌，所占比例約為19.02%.在根際土壤中，Actinobacteria所占比例范圍在15%～27%之間，而Sphingobacteria只約占2%［23］.

屬分類水平上共檢測到460多種微生物，如圖2b所示.Sphingomonas（鞘氨醇單包菌屬）為SD、GD和SH 3種土樣的優勢菌，分別占7.25%、10.67%、11.30%.它是清理土壤中有毒物質最有效的微生物群類之一，能夠降解芳香化合物（如萘、聯苯、甲苯、二甲苯、甲酚、氧芴等）和聚乙烯醇等［24］，且芳香族化合物是土壤氣體中主要的揮發性有機物，占71.5%［25］.有許多研究者從土壤中分離出不同種類的Sphingomonas.Srinivasan等［26］于2011年從位于韓國科技技術學院的池塘附近土壤中分離出了Sphingomonas屬的兩株菌PB196T和PB62T，但在垃圾填埋場覆蓋土中分離得到Sphingomonas尚未見報道.

由于城市生活垃圾分類不均等原因，填埋場中垃圾組成十分復雜，主要含有裝飾品、食物殘渣、塑料、紡織品、玻璃等，其中纖維素物質占總垃圾量的40%～70%［27］.在填埋過程中，生活垃圾會放出大量惡臭物質，嚴重污染周邊環境.其中H2S最普遍，且最典型，占微量填埋氣污染物的90%以上［28-29］.有研究表明硫氧化細菌（SOB）如Thiobacillus（硫桿菌屬）、Halothiobacillus（鹽硫桿菌屬）和Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）為中國亞熱帶地區垃圾填埋覆蓋土中的優勢菌群，且土壤中的有機含量對這些微生物活性具有較大影響［30］.從圖2b中也可發現，SD土樣中含有11.38%的Thiobacillus，為主要優勢菌，且在表3中，OM與Alphaproteobacteria （r=-1.00， P＜0.001）具有明顯的負相關性，與Betaproteobacteria （r=0.8，P=0.2）具有顯著的相關性，這可能是因為山東萊蕪城市供熱和天然氣的逐漸推廣和使用，生活垃圾組成成分中的有機物含量增多，致使生物氣中含有大量的硫化物.從圖2b中還可知， Oxalobacter （草酸桿菌屬）和Sandaracinus（橙色菌屬）為CQ土樣的優勢菌，分別占12.77%、18.11%，但相關的文獻報道還較少.從屬分類水平上的微生物群落組成圖可知，甲烷氧化菌并不是4種覆蓋土樣的優勢菌，這與Alphaproteobacteria中的甲烷氧化菌為主要優勢菌的結論具有差異［31］.

圖2 綱和屬分類水平下的微生物群落組成Fig.2 Composition of bacterial community at class and genera levels

2.4 環境因素對微生物群落的影響

圖3 OTU分類水平下的heatmapFig.3 Rainbow color percentage heatmap for OTU level

2.4.1 群落組成的相似性分析 樣品中前100個OTU豐度比例，如圖3所示.從圖3可看出，不同地區OTU相對豐度明顯不同，其中OTU1017和OTU2028在CQ土樣中相對豐度明顯高于其他土樣，分別為13.52%、19.76%；OTU1124和OTU101在SD土樣中相對豐度高于其他土樣，分別為9.11%、15.69%；OTU813在GD土樣中相對豐度最高，為9.57%；OTU59和OTU1906在SH土樣中相對豐度高于其他土樣，分別為11.62%、10.11%.從圖中樣品間聚類關系樹可知GD和SH土樣間序列的進化關系相近，而CQ土樣與其他土樣間的序列進化關系較遠.這可能是由于兩地區的TN含量相似，有研究表明垃圾填埋土中TN與土壤中微生物酶的活性具有明顯的相關性，而酶的活性與微生物數量具有顯著的相關性（r=0.98302，P＜0.001）［1］.

2.4.2 環境因子與優勢菌群的相關性分析 土壤中的各種物質會抑制或促進相應微生物的生長，使優勢菌群發生相應變化.Im等［31］研究表明N含量的增加會減少甲烷氧化菌群的多樣性，特別是I型甲烷氧化菌，而NH4Cl和KNO3的加入會顯著增加甲烷氧化菌群豐度.此外，土壤中有機磷和無機磷的加入也能增加微生物的活性［32］.相關性分析能夠初步的反應理化性質等環境因素對菌群豐度的影響，如表3所示.從表中發現TN和TP含量與3種優勢菌群的相對豐度具有密切關系，Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria相對豐度分別與TN（r=1.00，P＜0.001）和TP（r= 1.00， P＜0.001）具有明顯的正相關性，而Gemmatimonadetes相對豐度與TN（r=-1.00，P＜0.001）具有明顯的負相關性，但其相對豐度與TP（r=-0.40，P=0.6）關聯.同樣地，土樣中OM、N-N、N-N含量與一些優勢菌群的相對豐度也有密切關系.Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Anaerolineae相對豐度分別與N-N（r=1.00，P＜0.001）、OM（r=1.00，P＜0.001）和N-N（r=1.00，P＜0.001）含量呈正相關.對于N-N，相關研究表明N-N含量對Betaproteobacteria中的Burkholderia（伯克氏菌屬）、Azospiril（固氮螺菌屬）等固氮微生物有顯著的影響［33］，表3中也發現Betaproteobacteria相對豐度與N-N（r=1.00，P＜0.001）密切正相關，且Sphingobacteria（鞘氨醇桿菌綱）相對豐度與N-N（r=1.00，P＜0.001）也具有密切的正相關性.而主要的-N匯為自養硝化細菌［34］，Nitrosomonas（亞硝化單胞菌屬）、Nitrosospira（亞硝化螺菌屬）等屬于Betaproteobacteria的硝化細菌與N-N具有一定的相關性，而在本研究中發現Betaproteobacteria（r=0.20，P=0.80）與N-N無明顯相關性.

表3 細菌種群與理化性質全氮（TN）、全磷（TP）、有機質（MO）、銨態氮（N-N）和硝態氮（N-N）含量的相關性分析Table 3 The correlation （r） and significance （P） values of linear regressions between relative abundances of bacterial groups and soil total nitrogen （TN）， total phosphorus （TP）， organic matter （OM）， ammonium nitrogen （N-N） and nitrate nitrogen （N-N）

表3 細菌種群與理化性質全氮（TN）、全磷（TP）、有機質（MO）、銨態氮（N-N）和硝態氮（N-N）含量的相關性分析Table 3 The correlation （r） and significance （P） values of linear regressions between relative abundances of bacterial groups and soil total nitrogen （TN）， total phosphorus （TP）， organic matter （OM）， ammonium nitrogen （N-N） and nitrate nitrogen （N-N）

種群 TN TP OM NH4+-N NO3--N r P r P r P r P r P Acidobacteria -0.8 0.2-0.2 0.80 1-0.8 0.2-0.4 0.6 Actinobacteria -0.8 0.2 0 1 -0.8 0.2 -0.2 0.8 -1 ＜0.001 Alphaproteobacteria -0.6 0.4 -0.4 0.6 -1 ＜0.001 0.4 0.6 -0.8 0.2 Anaerolineae -0.4 0.6 0.4 0.6 0.4 0.6 -1 ＜0.001 -0.2 0.8 Betaproteobacteria 0.8 0.2 0 1 0.8 0.2 0.2 0.8 1 ＜0.001 Cytophagia 0.4 0.6 0.4 0.6 -0.4 0.6 0.6 0.4 -0.2 0.8 Deinococci -0.2 0.8 0.8 0.2 0.2 0.8 -0.8 0.2 -0.4 0.6 Deltaproteobacteria 1 ＜0.001 0.4 0.6 0.6 0.4 0.4 0.6 0.8 0.2 Gammaproteobacteria 0.4 0.6 1 ＜0.001 0.4 0.6 -0.4 0.6 0 1 Gemmatimonadetes -1 ＜0.001 -0.4 0.6 -0.6 0.4 -0.4 0.6 -0.8 0.2 Spartobacteria 0.8 0.2 0.2 0.8 0 1 0.8 0.2 0.4 0.6 Sphingobacteria 0.8 0.2 0 1 0.8 0.2 0.2 0.8 1 ＜0.001

2.4.3 環境因子與樣品之間的相關性分析 4種樣品因環境因素的不同而聚類或分離的情況，如圖4所示.從圖4中可看出，SD和CQ與SH、GD土樣的微生物組成差異較大，土樣都分散于第一、二、四象限內.這可能是因為CQ土樣N-N含量顯著的高于其他土樣，且N-N含量顯著高于SH和GD土樣.而對于SD樣，TN、TP和OM含量是造成該土樣與其他土樣分離的主要因素，其TN、TP和OM含量明顯高于其他土樣.Xiong等［35］研究表明土壤參數（TN、TC和水分）對土壤細菌群落組成的變化為37.52%. SH、GD土樣的微生物組成比較相似，主要聚集在第一象限中，主要原因可能是SH、GD土樣TN、TP、OM和N-N的含量適中，N-N含量明顯少于其他2種土樣.不同理化性質對不同覆蓋土微生物群落組成的影響不同.有研究表明環境的異質性和擴散限制是決定微生物地理分布格局的兩個主要的因素［36］，上述結果突出了覆蓋土中的環境異質性對微生物地理分布的影響.

圖4 基于土樣和環境因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis（RDA）based on binary data and environmental factors of the soil samples

3 結論

3.1 利用高通量測序技術分析樣品，平均覆蓋率為98.92%，測序結果能夠全面的反映樣品組成及結構. 多樣性指數可得4種樣品的物種豐富度順序為GD＞SH＞SD＞CQ.

3.2 垃圾填埋場覆蓋土中優勢菌綱為Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱），所占比例范圍分別為12.67%～25.54%，14.35%～18.88%. Sphingomonas（鞘氨醇單包菌屬）為SD、GD和SH 3個城市覆蓋土中的優勢菌屬，分別占7.25%、10.67%、11.30%.

3.3 覆蓋土中Deltaproteobacteria（德耳塔變形桿菌綱）和Gammaproteobacteria（γ-變形菌桿綱）相對豐度分別與TN（r=1.00，P＜0.001）和TP（r= 1.00， P＜0.001）呈正相關關系，且TN、TP和OM含量可能為SD土樣區別于其他土樣群落組成的主要因素.

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Analysis of bacterial community composition in landfill cover soil.

HE Zhi1， ZHAO Tian-tao1，2*， XING Zhi-lin1，2，YUAN Jiang-hua1（1.School of Chemical Engineering， Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China；2.School of City Construction and Environment Engineering， Chongqing University， Chongqing 400030， China）. China Environmental Science， 2015，35（12）：3744～3753

In this study， the bacterial community composition in 4geographically different location （Shandong Laiwu， SD； Guangdong Shenzhen， GD； Shanghai Laogang， SH； Chongqing Changshengqiao， CQ） was investigated by Illumina MiSeq sequencing targeting V3～V4region of 16S rDNA gene and the link between the bacterial community composition and environmental parameters was analyzed. Results showed that representatives of Alphaproteobacteria and Betaproteobacteria dominated at all 4cover soils， ranging from 12.67%～25.54% and 14.35%～18.88% of the total abundance， respectively. Cover soil of GD had higher bacterial diversity than the others， which suggested by Shannon index （5.52±0.026 Vs 4.76±0.030 of SD， 4.89±0.037 of SH， and 3.43±0.027 of CQ）. Genus Sphingomonas dominated at cover soils of SD、GD and SH， accounting for 7.25%、10.67%、11.30% of the total abundance， respectively. Person correlation suggested that groups of Deltaproteobacteria and Gammaproteobacteria highly correlated to total nitrogen（TN） （r=1.00， P＜0.001） and total phosphorus （TP） （r=1.00， P＜0.001）. Redundancy analysis （RDA） further indicated that TN、TP and organic matter （OM） are the important factors in shaping the bacterial community structure.

Illumina MiSeq sequencing；landfill cover soil；bacterial diversity；bacterial community structure； environmental factors

X505

A

1000-6923（2015）12-3744-10

何 芝（1991-），女，重慶大足人，碩士，主要從事環境微生物多樣性分析及污染控制研究.

2015-04-16

國家自然科學基金項目（51378522，41502328）；重慶市基礎與前沿研究項目（cstc2014jcyjA20007）

* 責任作者， 教授， zhaott@cqut.edu.cn