HIF-1α和c-MET在胃癌中的表達及其與血管生成和預后的相關性

蘇會玲 蘇紅慧 張培新 藺 強 陳 坤 劉風玲

胃癌在我國是1種常見的惡性腫瘤，據統計2010年全國胃癌新發病人數為404 565例、死亡287 851例，位列惡性腫瘤發病率的第2位、死亡率的第3位［1］。盡管目前隨著診療手段的進步，早期胃癌的預后有了比較大的提高，但晚期胃癌的預后仍然較差，其5年生存率僅為 15%左右［2］。早在 1986年，Dovrak［3］就提出將腫瘤看做是“沒有治愈的創傷(wound that do not heal)”這一經典理論，隨后大量的實驗證實許多信號轉導通路在腫瘤發展與普通傷口愈合過程中有著驚人的相似性，其中血管生成及其相關信號轉導通路在腫瘤的侵襲與轉移中起著重要的作用。本研究通過對胃癌組織中低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、c-MET受體及 CD34 的表達情況進行檢測，進一步分析HIF-1α和c-MET受體與胃癌各臨床病理特征及胃癌組織血管生成之間的關系，為判斷胃癌的預后及靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

按照患者術前檢查資料完善、手術記錄及術后病理資料完整、胃癌原發灶位于食管齒狀線以下至幽門部位及術前未行新輔助放化療的入組標準，除外胃部良性腫瘤、殘胃癌及既往患有其他惡性腫瘤的患者，最終本研究共收集華北石油總醫院普外科2003年9月1日至2008年8月18日之間行手術治療的74例患者的胃癌組織及相應的癌旁組織(距癌灶2～5 cm)。74例患者的臨床病理特征見表1。其中，男性56例，平均年齡61歲;女性18例，平均年齡55歲;按腫瘤分化程度，高分化5例，中分化17例，低分化及未分化52例;按照AJCC第六版TNM分期，T18例，T28例，T348例，T410例;N023例，N123例，N221例，N37例;M065例，M19例;Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期26例，Ⅳ期25例。

1.2 實驗試劑

免疫組化所需兔抗人HIF-1α、c-MET、原始造血細胞(CD34)單克隆抗體、山羊抗兔IgG/HRP多聚體及DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，其他試劑由華北石油總醫院病理科提供。

1.3 實驗方法

采用免疫組織化學SP法，蠟塊切成厚約4 μm放入60℃烘箱內烤片過夜;脫蠟;抗原微波熱修復;內源性過氧化物酶滅活;滴加山羊血清封閉液;滴加兔抗人HIF-1α或兔抗人c-MET或兔抗人CD34單克隆抗體工作液，37℃孵育2 h;滴加山羊抗兔IgG/HRP多聚體，溫育30 min;滴加DAB顯色劑;蘇木精復染，中性樹膠封片。

1.4 結果判定

1.4.1 HIF-1α 和c-Met陽性的判定 HIF-1α 陽性染色為細胞核或胞質呈黃色或棕黃色顆粒，c-Met陽性染色為細胞胞質著色呈黃色或棕黃色顆粒。應用Mattern積分法，即由染色陽性細胞的百分比和染色強度進行評估。每例標本選擇含有陽性細胞的5個高倍鏡視野(×400)，并計數100個腫瘤細胞，最后取其平均值作為陽性細胞百分率，0分:陽性細胞率為=0%，1分:陽性細胞≤10%，2分:陽性細胞率≤50%，3分:陽性細胞率＞50%;染色強度評估，0分:陰性，1分:淺黃色，2分:深黃色，3分:棕黃色。最終將上述兩項相加，總分≤1視為HIF-1α或c-Met陰性表達，總分≥2判定為陽性表達。

1.4.2 MVD的判定 采用 Weidner法判斷陽性結果，在腫瘤組織內，被CD34染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇，與其相鄰的腫瘤細胞、微血管及其他結締組織分開，可視為一個血管計數。在低倍鏡下(×100)尋找腫瘤組織中血管密度最高的區域，隨后在高倍鏡下(×400)選取5個血管最高密度區的微血管數，取均值代表MVD，但染色不清楚、管壁有纖維組織及肌層的存在、管腔直徑＞8個紅細胞以及伴有壞死或炎癥的微血管均不計入總數。

以上均由病理科兩名醫師采用單盲法進行閱片。

1.5 隨訪

所有患者隨訪日期自手術日起至2014年12月31日。

1.6 統計方法

應用SPSS 13.0統計學軟件進行統計分析，HIF-1α、c-Met受體與各臨床病理參數之間采用χ2檢驗;兩變量相關性采用Spearman等級相關進行分析，生存分析采用Kaplan-Meier分析，并用Log-rank法檢驗。以上均以P＜0.05作為有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織中HIF-1α及c-Met的表達

免疫組化結果顯示，HIF-1α陽性表達主要位于細胞核，部分胞質中也可見陽性表達。c-Met陽性表達主要位于胃癌細胞的細胞質中。免疫組化結果證實胃癌組織中HIF-1α陽性表達率為74.3%(55/74)，癌旁組織中其陽性表達率為12.2%(9/74)，二者比較具有顯著差異(P＜0.05);胃癌組織c-Met陽性表達率為66.2%(49/74)，而癌旁組織其陽性表達率為21.6%(16/74)，二者比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 胃癌組織中HIF-1α和c-Met的表達與其臨床病理參數的關系

HIF-1α在胃癌患者癌組織中的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及分期具有顯著相關性(P＜0.05);而c-Met受體的表達受腫瘤分化程度、浸潤深度及分期的影響(P＜0.05)，見表1。

表1 HIF-1α、c-Met表達與胃癌臨床病理特征的關系(例，%)

2.3 胃癌組織中HIF-1α表達與c-Met的關系

74例胃癌患者中，HIF-1α與c-Met的表達同為陽性者42例，同為陰性者12例，兩者的表達呈顯著相關性(γ =0.365，P＜0.05)。

2.4 胃癌組織中HIF-1α、c-Met表達與MVD的關系

CD34陽性表達的管腔樣結構為胃癌微血管。HIF-1α陽性表達的胃癌組織 MVD為(45.22±14.65)，較 HIF-1α陰性表達組的顯著升高(P＜0.05);c-Met陽性表達的胃癌組織MVD為(45.33±14.23)，也高于 c-Met陰性組的(P＜0.05)，見表2。

表2 HIF-1α及c-Met的表達與胃癌MVD的關系

2.5 HIF-1α及c-Met的表達與胃癌患者預后的關系

截至2014年12月31日，74例患者中62例死于胃癌，入組患者的中位生存時間為20.0個月。應用Kaplan-Meier法進行生存分析，并經 Log-rank檢驗，HIF-1α陽性表達患者的生存時間顯著短于陰性表達患者(P＜0.05)，c-Met陽性表達患者生存時間也顯著短于陰性表達患者(P＜0.05)。進一步分析發現HIF-1α和c-Met共表達患者的中位生存時間僅有14.0個月，較非共表達組患者的生存時間顯著縮短(P＜0.05)，見圖1。

3 討論

腫瘤細胞的快速增殖及腫瘤血管結構和功能的異常降低了實體瘤內部的血液供應［4］。目前，越來越多的研究證實原發腫瘤的低氧微環境與腫瘤的轉移及不良預后相關［5-6］。腫瘤細胞為了適應低氧微環境可以使HIF1、HIF2的表達上調［7］，而低氧微環境和HIF可以進一步引起其他基因的轉錄從而影響腫瘤血管生成、腫瘤細胞代謝、侵襲等生理過程［8］。

圖1 胃癌中HIF-1α、c-Met的表達與生存時間的關系

Chen等［9］對446例經手術治療的胃癌患者的病理標本行免疫組化研究，結果顯示HIF-1α的強陽性表達率為48.7%，進一步分析顯示HIF-1α在肝轉移及腹腔轉移的胃癌患者中表達顯著升高，HIF-1α強陽性表達患者的PFS及OS顯著縮短 。Chen等［10］對HIF-1α與胃癌臨床病理特征及預后進行了Meta分析，結果顯示HIF-1α的表達與胃癌組織的分化程度、侵潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期顯著相關(P＜0.05)，HIF-1α高表達胃癌患者的5年生存率顯著低于低表達組(Rr=1.508，95%CI:1.318～1.725，P=0.001)。本研究顯示 HIF-1α 在胃癌組織中的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及分期具有顯著相關性，并且HIF-1α陽性表達的胃癌患者生存時間顯著縮短，這與前述的研究結果基本相一致，提示HIF-1α在胃癌的發生及疾病進展中有一定的意義。

Peng等［11］共納入14項研究2258例胃癌患者的Meta分析顯示c-Met高表達胃癌患者的生存時間顯著縮短(Hr=2.57，95%CI:1.97～3.35，P=0.013)，而Yu等［12］納入15項研究2210例胃癌患者的Meta分析與 Peng的研究結果相似(Hr=2.112，95%CI:1.622～2.748，P=0.007)。本實驗顯示 c-Met受體的表達與胃癌組織的分化程度、浸潤深度及分期顯著相關，c-Met陽性表達患者的預后不佳，這與Peng和Yu的研究相一致，提示c-Met可以作為判斷胃癌患者預后的指標。

目前研究證實低氧誘導腫瘤細胞的增殖主要依靠兩種機制。首先，低氧條件對正常細胞及腫瘤細胞均會產生毒性，某些細胞內部通過基因突變在此極端環境下存活［13］;其次，低氧激活腫瘤血管生成、上皮間質轉化等相關信號通路促進腫瘤細胞轉移。本研究顯示，HIF-1α與c-Met的表達顯著相關，并且HIF-1α及c-Met陽性表達的胃癌組織中MVD顯著增高，提示HIF-1α、c-Met參與胃癌腫瘤微環境中血管的生成;進一步的生存分析顯示HIF-1α和c-Met共表達患者的生存時間顯著縮短，這可能與低氧條件刺激腫瘤血管生成及上皮間質轉化進而促進胃癌的轉移等過程相關。Pennacchietti等［14］的實驗證實腫瘤組織內低氧區域存在c-Met受體的表達，HIF-1可以誘導c-Met原癌基因的激活。Corso等［15］的實驗顯示沉默腫瘤細胞中的c-Met的表達可顯著降低腫瘤細胞的增殖及侵襲性。Matsumura等［16］的研究發現 HIF-1α上調 c-Met的表達可以進一步激活PI3K/Akt、MAPK、STAT3等下游信號通路基調節VEGF的表達，靶向HGF/c Met信號通路可以抑制腫瘤血管的生成。

隨著腫瘤微環境領域研究的深入以及轉化醫學的興起，腫瘤抗血管生成治療以逐漸進入臨床。Ramucirumab是靶向VEGFR2的單克隆抗體，可以抑制腫瘤血管的生成，隨著REGARD臨床試驗［17］結果的公布，2014年4月FDA批準了Ramucirumab單藥應用于晚期胃癌，這為胃癌患者帶來了新的希望。相信隨著對HIF-1α及c-Met信號通路的系統研究及相關靶向藥物的問世，高選擇性的靶向藥物能夠延長HIF-1α或c-Met陽性表達胃癌患者的生存時間，為胃癌患者的個體化治療提供更加有效的藥物。

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