穴位埋線對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎治療作用的研究

鄭鳳鳴 郝小波 趙建英 張 蓮 郭大東

穴位埋線對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎治療作用的研究

鄭鳳鳴1郝小波2趙建英2張 蓮3郭大東4

目的探討穴位埋線對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用。方法Liwes大鼠48只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、穴位埋線組，每組16只。將光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（IRBP）、結(jié)核桿菌（TB）和完全弗氏佐劑（CFA）磷酸緩沖鹽溶液（PBS）制成乳糜液后，在雙足后墊及背部?jī)蓚?cè)皮下注射。穴位埋線組于造模后第二天進(jìn)行穴位埋線；模型組、穴位埋線組于造模后第9、13、18、23 d采集心臟血液并分離淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，同時(shí)對(duì)眼球進(jìn)行組織病理切片。結(jié)果造模后第6至7 d大鼠眼部開(kāi)始出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，第13 d炎癥達(dá)高峰（模型組臨床評(píng)分為：3.42±0.58；穴位埋線組為：2.17±0.68，P=0.018，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），之后逐漸開(kāi)始消退。組織病理學(xué)結(jié)果顯示模型組在第9、13、18、23 d時(shí)虹膜，睫狀體及視網(wǎng)膜炎癥均比穴位埋線組嚴(yán)重，而空白對(duì)照組眼部結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯炎癥表現(xiàn)；流式細(xì)胞儀分析顯示第13 d CD4+T占細(xì)胞比例最高值：模型組為85.97±1.03，穴位埋線組為：79.51±0.64，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；第13 d時(shí)CD8+T最低：模型組為：14.03±1.03，組為：20.49±0.64，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)論眼形態(tài)學(xué)、組織病理、細(xì)胞水平等結(jié)果顯示，穴位埋線可有效減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠炎癥水平，對(duì)大鼠的葡萄膜炎具有治療作用。

穴位埋線；自身免疫；葡萄膜炎；流式細(xì)胞術(shù)；組織病理學(xué)

葡萄膜炎是一類嚴(yán)重威脅人類視覺(jué)健康的自身免疫性眼病，多發(fā)生于青壯年，具有病因復(fù)雜多樣、病情長(zhǎng)且易反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，我國(guó)約有500萬(wàn)患者，是我國(guó)亟待解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前治療主要以糖皮質(zhì)激素及相應(yīng)的抗炎藥為主，使用周期長(zhǎng)，副作用非常明顯，可引發(fā)患者免疫功能紊亂等全身性并發(fā)癥，且患者在停藥或者減少服藥劑量后經(jīng)常出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)或者加重。近年來(lái)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，將糖皮質(zhì)激素直接注射入玻璃體腔內(nèi)，雖不易引發(fā)全身并發(fā)癥，但易引發(fā)白內(nèi)障、眼內(nèi)炎、眼壓升高等眼局部并發(fā)癥〔1〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，穴位埋線對(duì)慢性葡萄膜炎具有一定的治療作用〔2〕，患者依從性好。本實(shí)驗(yàn)主要研究穴位埋線對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠（experimental autoimmune uveitis，EAU）的作用機(jī)制，為穴位埋線治療葡萄膜炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康Lewis大鼠48只（購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證為SCXK（蘇）2011-0003），CL級(jí)別，體重130～170 g，均為雌性。所有動(dòng)物均按照視覺(jué)與眼科學(xué)研究學(xué)會(huì)中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼科與視覺(jué)研究實(shí)驗(yàn)的要求飼養(yǎng)與處理。

埋線材料及主要實(shí)驗(yàn)試劑、儀器：埋線材料由北京任曉艷穴位埋線醫(yī)療研究中心提供［專利號(hào)：2004200665990，京藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2005第2270643號(hào)，京藥管械生產(chǎn)許20040062號(hào)］；光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（IRBP，1177-1191，氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV）由上海生工生物工程股份有限公司合成；結(jié)核菌素（tuberculin，TB）購(gòu)自美國(guó)Difco公司；完全弗氏佐劑（complete freund's adjuvant，CFA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Phycoerythrin（PE）anti-rat CD8a和FITC Mouse Anti-Rat CD4購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；1640為Gibco公司產(chǎn)品。Genesis-D動(dòng)物眼部照相機(jī)（日本Kowa公司）；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD FACSVerse產(chǎn)品；顯微鏡（Olympus IX71）由日本公司生產(chǎn)，超速冷凍臺(tái)式離心機(jī)由香港力康公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物分組與（葡萄膜炎誘導(dǎo)）造模

分組：將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為對(duì)照組（注射生理鹽水）、模型組（造模后無(wú)任何干預(yù)措施）、穴位埋線組（造模后第2天行穴位埋線）每組16只。

免疫性葡萄膜炎（EAU）模型建立：Lewis大鼠在動(dòng)物房飼養(yǎng)1周后在裂隙燈下排除眼部疾病，然后進(jìn)行造模處理。參照文獻(xiàn)〔3-5〕方法按每只IRBP 100 μg、TB 100 μg、CFA 150 μl與PBS 150 μl充分混勻，制備乳糜液。麻醉后分別于雙后足墊及脊柱正中兩旁皮下共4個(gè)部位，共注射300 μl乳糜液，以誘導(dǎo)大鼠發(fā)生實(shí)驗(yàn)性自身EAU。

埋線方法：（1）選穴：依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及華興邦等所著大鼠穴位圖譜〔6，7〕脾俞，第12胸椎下兩旁；肋間，左右側(cè)各一穴；腎俞：第2腰椎下兩旁，左右側(cè)各一穴。（2）消毒：在超凈臺(tái)內(nèi)選取穴位后，用醫(yī)用酒精消毒穴位及周圍皮膚。（3）進(jìn)針：將1 cm羊腸線推入相應(yīng)穴位皮下至肌層，線頭不外露，無(wú)菌棉簽按壓針孔處止血。每穴1針。

埋線后立即更換干燥清潔墊料。

1.3 觀察指標(biāo)

大鼠眼部炎癥觀察；于造模后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23天分別對(duì)造模大鼠應(yīng)用Genesis-D動(dòng)物眼部照相機(jī)記錄眼前節(jié)變化，根據(jù)文獻(xiàn)〔8〕進(jìn)行眼部炎癥評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分：無(wú)炎癥；1分：虹膜血管輕/中度擴(kuò)張充血、瞳孔縮??；2分：前房輕度混濁；3分：前房中度混濁，但仍可見(jiàn)瞳孔；4分：前房重度混濁、積膿、瞳孔膜閉、眼球前突。

大鼠眼球組織病理學(xué)觀察：造模后第9、13、18、23天麻醉，心臟取血，然后處死。隨機(jī)選取兩只大鼠摘取同側(cè)眼球，立即置于4%多聚甲醛中4℃固定48小時(shí)。經(jīng)脫水、包埋、切片，常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠前房、虹膜、睫狀體炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況及組織結(jié)構(gòu)情況。

細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析致病性抗原特異性T淋巴細(xì)胞中CD4+T、CD8+T所占比例。參照文獻(xiàn)〔4〕方法分離大鼠淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞，按照試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行PE-CD8+、FITC-CD4+T細(xì)胞表面染色，立即行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

上述所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1～3 免疫后第13 d通過(guò)Genesis-D動(dòng)物眼部照相機(jī)觀察大鼠眼前節(jié)炎癥情況。圖1空白組眼前部無(wú)炎癥改變；圖2穴位埋線組虹膜充血，瞳孔縮小并粘連；圖3造模組虹膜充血嚴(yán)重，瞳孔膜閉，前面大量滲出。

圖4～9 造模后第13 d大鼠虹膜（4、6、8）、睫狀體（5、7、9）組織病理學(xué)（HE，×200）。圖4～5為空白組虹膜，睫狀體，未見(jiàn)明顯變化；圖6～7分別為造模組虹膜，睫狀體，有大量炎性細(xì)胞聚集，虹膜、睫狀體有粘連；圖8～9分別為穴位埋線組虹膜，睫狀體，炎性細(xì)胞較造模組少，但仍可見(jiàn)，其中虹膜、睫狀體未見(jiàn)粘連。

2 結(jié)果

2.1 大鼠眼部炎癥表現(xiàn)

Genesis-D動(dòng)物眼部照相機(jī)觀察發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組眼部無(wú)炎癥改變（圖1）。穴位埋線組第8～9 d開(kāi)始出現(xiàn)輕微眼部炎癥，第13 d眼部炎癥反應(yīng)較重（臨床評(píng)分為2.17±0.68），虹膜充血嚴(yán)重，房水混濁，瞳孔縮小并粘連（圖2）；模型組于第6～7 d開(kāi)始出現(xiàn)輕度眼部炎癥，表現(xiàn)為虹膜血管輕度擴(kuò)張充血，瞳孔無(wú)明顯變化；第13 d為眼部炎癥的高峰期（臨床評(píng)分為3.42±0.58），虹膜充血嚴(yán)重，前房大量纖維素樣滲出，瞳孔膜閉，眼球前凸（圖3），隨后眼部炎癥逐漸消退。第13 d埋線組與模型組臨床癥狀得分比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 大鼠眼前節(jié)組織病理學(xué)改變

眼球組織病理切片顯示造模后第13 d炎癥反應(yīng)最重。空白對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，虹膜、睫狀體未發(fā)現(xiàn)組織形態(tài)學(xué)上的改變（圖4）；模型組（圖5）大鼠眼前房有大量炎性細(xì)胞聚集，虹膜、睫狀體有黏連，同時(shí)發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等；穴位埋線組虹膜、睫狀體未發(fā)生粘連，眼前節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比模型組癥狀輕（圖6）。

2.3 T淋巴細(xì)胞中CD4+T、CD8+T所占比例變化情況

淋巴結(jié)組織提取T細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組和穴位埋線組隨著病情發(fā)展，CD4+T、CD8+T占T細(xì)胞比例也相應(yīng)發(fā)生改變。

CD4+T：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模8、13、18、23 d后，模型組CD4+T占T細(xì)胞百分比（%）分別為75.02±0.45，85.97±1.03，80.12±1.82，76.73±2.44；穴位埋線組CD4+T占T細(xì)胞百分比（%）分別為73.06±0.85，79.51±0.64，74.79±1.05，73.50±0.70，模型組與穴位埋線組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第13天為炎癥高峰期，CD4+值占T細(xì)胞百分比最高，其中模型組高于穴位埋線組（圖10-A）。隨著炎癥消退，CD4+T占總T細(xì)胞百分比逐漸變小。

CD8+T：造模后8、13、18、23 d，模型組中CD8+T占T細(xì)胞百分比分別為24.98±0.44，14.03±1.03，19.88±1.82，23.27±2.44；穴位埋線組分別為26.94± 0.64，20.49±0.64，25.21±1.05，26.50+0.70，P＜0.05，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。第13天炎癥高峰期時(shí)CD8+值最低，且模型組低于穴位埋線組（圖10-B），隨著炎癥消退其值也逐漸增大，但空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在23天時(shí)模型組CD4+/CD8+與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明模型組炎癥基本消退；但我們發(fā)現(xiàn)穴位埋線組與對(duì)照組相比P＜0.05，說(shuō)明埋線在23 d時(shí)可能存在免疫負(fù)反饋的作用。

圖10 13d時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC-CD4+、PE-CD8+所占比例。A1為造模組FITC-CD4+所占比例，A2為造模組PE-CD8+所占比例。B1為穴位埋線組FITC-CD4+所占比例，B2為穴位埋線組PE-CD8+所占比例。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)三組大鼠淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞CD4+T、CD8+T百分比（%）

3 討論

研究表明，針灸對(duì)慢性炎癥性疾病具有雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)炎性因子具有良好的調(diào)控作用，能使過(guò)低或過(guò)強(qiáng)的免疫功能恢復(fù)到正常水平〔9〕。穴位埋線是在基于傳統(tǒng)針灸以及穴位注射的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，通過(guò)特殊的針具將可吸收的羊腸線埋入穴位內(nèi)，從而產(chǎn)生一種生物化學(xué)反應(yīng)，其同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用。崔謹(jǐn)?shù)取?0〕認(rèn)為埋植于體內(nèi)的羊腸線是一種異體蛋白，如同異種組織移植，其中的抗原可使人體淋巴細(xì)胞致敏，致敏細(xì)胞又配合體液中的抗體、巨噬細(xì)胞等反應(yīng)來(lái)破壞、軟化、分解、液化羊腸線，使之變?yōu)槎嚯?、氨基酸，最后被吞噬、吸收，同時(shí)產(chǎn)生多種淋巴因子。這些抗原刺激對(duì)穴位產(chǎn)生的生物化學(xué)刺激，使局部組織產(chǎn)生無(wú)菌性炎癥，甚至出現(xiàn)全身反應(yīng)，從而提高人體的應(yīng)激能力，激發(fā)人體免疫功能，調(diào)節(jié)身體有關(guān)臟腑器官功能，使活動(dòng)趨于平衡。張利眾等〔11〕以背俞埋線為主配合叩刺華佗夾脊穴治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）38例，總療程1年，最初以原劑量服用激素，病情緩解后按常規(guī)撤減激素，結(jié)果顯效17例，有效15例，無(wú)效5例，總有效率84.2%，在臨床中取得了較好的效果。高德榮等〔12〕選用穴位埋線治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎2 039例，近期治愈571例，顯效795例，好轉(zhuǎn)632例，無(wú)效41例，總有效率為98%。其中埋線前服用激素治療的有1692例，埋線后停服者1582例，占93%。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)EAU大鼠模型眼前節(jié)炎性反應(yīng)觀察，發(fā)現(xiàn)在第13天時(shí)前房炎癥反應(yīng)最重，但穴位埋線組炎癥明顯低于模型組，與張利眾、高德榮等的臨床觀察結(jié)果相符。此結(jié)果表明穴位埋線可有效減輕葡萄膜炎的炎癥反應(yīng)，故該療法對(duì)葡萄膜炎具有積極的治療作用。

淋巴細(xì)胞主要包括T淋巴細(xì)胞（CD3+），B淋巴細(xì)胞（CD19+），NK（CD16+、CD56+）。成熟T淋巴細(xì)胞根據(jù)其表面標(biāo)志及功能的不同分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+、CD4+）、抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+、CD8+）兩大亞群。其中輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞主要的表面標(biāo)志是CD4+，抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞主要的表面標(biāo)志是CD8+。在正常情況下，這兩大亞群保持一定的數(shù)量及比例以維持正常的免疫功能，當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫性相關(guān)疾病時(shí)其平衡受到破壞。葡萄膜炎患者的臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)其病理變化與免疫功能變化密切相關(guān)，尤其是T淋巴細(xì)胞比例的變化。張馨等〔2〕將穴位埋線用于慢性葡萄膜炎的治療，發(fā)現(xiàn)穴位埋線聯(lián)合藥物治療對(duì)慢性葡萄膜炎患者的輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞（CD4+）的降低比單純藥物治療的明顯，相對(duì)的抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD8+）則升高的明顯。詹宇堅(jiān)等〔13〕研究了44例葡萄膜炎患者不同T淋巴細(xì)胞亞群的比例，發(fā)現(xiàn)CD4+細(xì)胞百分比升高和CD4+/CD8+值升高，而CD8+細(xì)胞比例下降，治療后上述表現(xiàn)均有改善。蘇衛(wèi)華〔14〕在EAU大鼠模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得出眼用凝膠穴位埋線組脾臟和淋巴節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞中CD4+，CD4+/CD8+比值比造模組低，CD8+升高。我們研究發(fā)現(xiàn)在第8、第13、第18、第23天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，CD4+在炎癥初期其值逐漸變大，炎癥后期其值逐漸變小，第13天炎癥高峰期值最高，其中造模組高于穴位埋線組；CD8+在炎癥初期其值逐漸變小，在炎癥后期其值逐漸增大，第13天炎癥高峰期值最低，其中造模組低于穴位埋線組，其值的動(dòng)態(tài)變化與T淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)疾病的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，證明穴位埋線能有效調(diào)節(jié)自身免疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型中T淋巴細(xì)胞的變化。

綜上所述，穴位埋線可有效減輕EAU大鼠模型的炎癥癥狀，減輕眼前節(jié)的病理變化，降低CD4+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比值，促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞的活化表達(dá)。但穴位埋線對(duì)后極部視網(wǎng)膜的病理變化的影響及對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的具體調(diào)節(jié)作用機(jī)制以及對(duì)二者之間的相互關(guān)系的影響有待進(jìn)一步研究。

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Therapeutic effect of catgut implantation at acupoint on rats with experimental autoimmune uveitis

ZHENG Fengming，HAO Xiaobo，ZHAO Jianying，et al.Postgraduate Student，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530000，Guangxi，China

OBJECTIVE To explore the therapeutic effect of catgut implantation at acupoint on rats with experimental autoimmune uveitis（EAU）.METHODS Forty-eight liwes rat were randomly divided into control group，model group，treatment group with 16 rats each.Control and treatment groups were immunized by IRBP，CFA，TB，the treatment group in second days after immunie by catgut implantation，All groups was collected blood and isolated lymphocyte after 9，13，18，23 days，and then analyzed by flow cytometry.Further inflammation symptom was observed and confirmed by histopathologic examination in eye.RESULTS Uveitis inflammation was observed on day 6 or 7 and the severity peaked on day13 post immunization（Clinical mean score：EAU group 3.42±0.58，Catgut group 2.17± 0.68）and there was statistically significant differences（P=0.000）.After then the inflammation gradually subsided. Meanwhile，the morphologic change of organizational structure of iris and ciliary body also showed significant differences between EAU group and catgut group on days 9，13，18，23.But there was no inflammatory cell with the iris and ciliary body on control group.The flow cytometry showed that CD4 T was the highest in T cells on day 13.EAU group：85.97±1.03，catgut group：79.51±0.64；CD8 T was the lowest in T cells on day 13.EAU group：14.03± 1.03，catgut group：20.49±0.64，and there was statisti cally significant differences（P=0.000）.COUCLUSIONS The morphologic change of organizational structure on eye，the flow cytometry，the histopathologyshowed that there was a certain therapeutic effect of catgut implantation at acupoint on rats with experimental autoimmune uveitis.

catgut implantation at acupoint；experimental autoimmune；uveitis；flow cytometry；histopathology

R773

A

1002-4379（2015）05-0309-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.001

1國(guó)家自然科學(xué)基金（81360558）

2山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013ZDZK-083）

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧530000

2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

3山東中醫(yī)藥大學(xué)

4山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所

通迅作者：郝小波，E-mail：562695922@qq.com