參萸明目合劑對糖尿病大鼠玻璃體及視網膜CTGF表達的影響

蘇風軍 韋企平 陸詩林 高 穎

參萸明目合劑對糖尿病大鼠玻璃體及視網膜CTGF表達的影響

蘇風軍1韋企平2陸詩林3高 穎2

目的探討參萸明目合劑對糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）大鼠玻璃體結締組織生長因子（CTGF）含量及視網膜CTGF表達的影響。方法用鏈脲佐菌素制備糖尿病模型。參萸明目合劑組給予參萸明目合劑，羥苯磺酸鈣組給予羥苯磺酸鈣灌胃，觀察大鼠全身情況，稱量體重、檢測血糖、血脂和玻璃體CTGF含量及視網膜CTGF的表達，并進行視網膜切片免疫組織化學染色。結果參萸明目合劑可明顯改善DR大鼠的生存狀況，降低DR大鼠血糖、血脂并可降低大鼠玻璃體CTGF含量和視網膜CTGF的陽性表達，對實驗性糖尿病視網膜病變有一定防治作用。結論參萸明目合劑能有效的保護大鼠視網膜微血管，降低毛細血管的通透性，防止視網膜病變向增殖期進展。

非增生型糖尿視網膜病變；參萸明目合劑；SD大鼠

結締組織生長因子（CTGF）是一種新近發現的致纖維化因子。糖尿病性視網膜病變與視網膜成纖維細胞增生、組織纖維化密切相關。近年來的研究顯示CTGF參與了糖尿病視網膜病變的發病機制，糖尿病視網膜病變患者玻璃體中該種因子含量隨病程延長而增多〔1〕。由此我們推測糖尿病視網膜病變發展至后期成為增殖性糖尿病視網膜病變時，其纖維增殖膜的形成可能與CTGF相關，抑制CTGF的產生或表達，有益于控制糖尿病視網膜病變的發展。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動物模型建立

由山東大學實驗動物中心提供二級SD大鼠58只，均為雄性，體重250±10 g。經裂隙燈及直接檢眼鏡檢查屈光間質清，眼底無異常者納入實驗。從中隨機選取45只大鼠，禁食12 h后，將2%鏈脲佐菌素以60 mg/kg體重行一次性腹腔注射，48 h后測大鼠空腹血糖＞16.7 mmol/L，尿糖＞+++，為造模成功〔2〕。未造模的13只為空白對照組。

1.2 分組和實驗方法

將45只糖尿病大鼠隨機分為參萸明目合劑組15只，羥苯磺酸鈣組15只，糖尿病模型組15只。空白組大鼠13只。實驗過程中糖尿病模型組死亡3只，故實際觀察糖尿病模型組大鼠12只。參萸明目合劑組以參萸明目合劑藥液0.5 g/kg·d（正常成人劑量的20倍）〔3〕灌胃，每日1次，持續10周。羥苯磺酸鈣組以羥苯磺酸鈣藥液0.5 g/kg·d（正常成人劑量的20倍）〔3〕灌胃，每日1次，持續10周。糖尿病模型組按給藥組等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續10周。空白組正常喂養，自由飲水。

1.3 組織學處理

糖尿病大鼠造模成功10周時，以水合氯醛腹腔注射全身麻醉，每只大鼠取左眼，于顳上象限角膜緣后1.5 mm經睫狀體平坦處用30 G注射器抽取0.03 ml玻璃體液，保存于-70℃，用酶聯免疫吸附法檢測其中CTGF含量。之后摘除眼球，以4%多聚甲醛固定，常規包埋制作石蠟切片，用酶聯免疫吸附法檢測視網膜CTGF含量。每只大鼠取右眼，摘除眼球，以10%中性福爾馬林固定，行HE染色后觀察視網膜結構。

1.4 檢測指標

（1）檢測造模成功時即治療前及治療4、6、8、10周血糖；檢測治療前及治療10周后體重、三酰甘油、膽固醇、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶；檢測治療10周后24 h尿蛋白。（2）采用酶聯免疫吸附法測定治療10周后玻璃體CTGF含量。（3）采用免疫組化方法檢測治療10周后視網膜CTGF含量。（4）HE染色光鏡觀察治療10周后視網膜結構。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 參萸明目合劑對糖尿病大鼠血糖代謝的影響

空白組大鼠的血糖值在各時間點保持正常而穩定。10周時糖尿病模型組、羥苯磺酸鈣組、參萸明目合劑組血糖均高于空白對照組，差異有統計學意義（F=27.21，P＜0.05），羥苯磺酸鈣組與糖尿病模型組差異無統計學意義（F=17.33，P＞0.05），參萸明目合劑組與糖尿病模型組差異有統計學意義（F=25.22，P＜0.05）。提示：參萸明目合劑可以降低糖尿病大鼠的血糖。各實驗組大鼠血糖值在8周內呈進行性升高，10周時參萸明目合劑組血糖增加幅度低于羥苯磺酸鈣組，差異有統計學意義（F=26.25，P＜0.001），提示參萸明目合劑對于降低糖尿病大鼠血糖有較好療效（表1）。

2.2 參萸明目合劑對糖尿病大鼠體重增長的影響

治療前后體重增加量空白組＞參萸明目合劑組＞羥苯磺酸鈣組＞糖尿病模型組。各組間進行單因素方差分析顯示：治療前各組體重差異無統計學意義（P＞0.05），治療后羥苯磺酸鈣組、糖尿病模型組體重與空白組比較，差異均有統計學意義（P＜0.001），羥苯磺酸鈣組和糖尿病模型組體重差異無統計學意義（P=0.54），參萸明目合劑組體重高于羥苯磺酸鈣組及糖尿病模型組，差異有統計學意義（P＜0.001），提示參萸明目合劑可使糖尿病大鼠體重增長趨于正常（表2）。

表1 各組大鼠治療前后血糖比較（±s，mmol/L）

表1 各組大鼠治療前后血糖比較（±s，mmol/L）

注：10周時各組與空白組比較，F=27.21，P＜0.05；羥苯磺酸鈣組與糖尿病模型組比較F=17.33，P＞0.05；參萸明目合劑組與糖尿病模型組比較，F=25.22，P＜0.05。

血糖值成模時4周6周8周10周空白組137.12±0.187.07±0.367.12±0.236.65±0.217.14±0.24糖尿病模型組1221.47±1.0723.28±0.8723.37±0.8224.56±0.3924.48±0.41羥苯磺酸鈣組1521.93±0.7823.25±1.2523.80±0.5924.07±0.4624.15±0.69參萸明目合劑組1522.13±1.0923.40±0.9423.07±0.5623.20±0.5722.93±0.63組別樣本數（只）

2.3 參萸明目合劑對糖尿病大鼠血脂代謝的影響

治療前各組三酰甘油差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后參萸明目合劑組、羥苯磺酸鈣組和空白組之間差異無統計學意義（P＞0.05），上述三組甘油三酯均低于糖尿病模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示參萸明目合劑和羥苯磺酸鈣對降低糖尿病大鼠三酰甘油有較好療效。治療前空白組總膽固醇低于各實驗組，差異有統計學意義（P＜0.05），各實驗組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后羥苯磺酸鈣組和糖尿病模型組差異無統計學意義（P＞0.05），參萸明目合劑組總膽固醇低于羥苯磺酸鈣組及糖尿病模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示參萸明目合劑對降低糖尿病大鼠的總膽固醇有較好療效（表3）。

表2 各組大鼠治療前后體重比較（±s，g）

表2 各組大鼠治療前后體重比較（±s，g）

注：組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。同一列字母上標不同者比較，P＜0.05。組內比較采用配對t檢驗

組別樣本數（只）治療前治療后tP空白組13251±5.51411±27.18a糖尿病模型組12252±4.71334±17.32b334.150.061羥苯磺酸鈣組15254±3.12339±11.84b337.190.056參萸明目合劑組15251±4.55459±7.23c435.620.03 F 1.331175.296 P 0.275＜0.001

2.4 參萸明目合劑對糖尿病大鼠肝功能的影響

谷丙轉氨酶（mmol/L）：羥苯磺酸鈣組大鼠治療前為55.62±6.79，治療后56.69±4.91；參萸明目合劑組治療前57.07±2.61，治療后56.44±1.89。谷草轉氨酶：羥苯磺酸鈣組治療前165.39±10.4，治療后166.79±10.5；參萸明目合劑組治療前163.57±8.87，治療后166.71±8.98。經單因素方差分析，參萸明目合劑組與羥苯磺酸鈣組大鼠治療前后谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶含量差異均無統計學意義（P＞0.05），提示參萸明目合劑和羥苯磺酸鈣治療期間對糖尿病大鼠肝功能均無明顯損害。

2.5 參萸明目合劑對糖尿病大鼠24h尿蛋白的影響

24 h尿蛋白的測定（mg/24 h）：空白組6.33±0.45，糖尿病模型組42.93±2.43，羥苯磺酸鈣組35.97±1.63，參萸明目合劑組33.92±1.32；經單因素方差分析，治療10周后參萸明目合劑組和羥苯磺酸鈣組大鼠24 h尿蛋白均低于糖尿病模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），參萸明目合劑組24 h尿蛋白低于羥苯磺酸鈣組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示參萸明目合劑和羥苯磺酸鈣均有降低糖尿病大鼠尿蛋白的療效，參萸明目合劑優于羥苯磺酸鈣。

2.6 參萸明目合劑對糖尿病大鼠玻璃體CTGF含量的影響

各組大鼠玻璃體CTGF含量（pg/mL）：空白組211.54±7.27，糖尿病模型組474.25±7.29，羥苯磺酸鈣組462.20±29.84，參萸明目合劑組353.73±8.17；經單因素方差分析，組間CTGF含量差異有統計學意義（P<0.05），t檢驗示：糖尿病模型組、羥苯磺酸鈣組均較空白組CTGF含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。參萸明目合劑組較對照組CTGF含量差異有統計學意義（P<0.05），參萸明目合劑組優于羥苯磺酸鈣組，表明參萸明目合劑能降低大鼠玻璃體CTGF含量，療效優于羥苯磺酸鈣組。

表3 各組大鼠治療前后三酰甘油和總膽固醇比較±s，mmol/L）

表3 各組大鼠治療前后三酰甘油和總膽固醇比較±s，mmol/L）

注：組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。同一列字母上標不同者比較，P＜0.05。組內比較采用配對t檢驗

組別樣本數（只）三酰甘油總膽固醇tP治療前治療后治療前治療后空白組130.79±0.110.83±0.92a0.810.071.35±0.211.48±0.09a1.380.060糖尿病模型組120.81±0.101.70±0.52b1.820.002.97±0.692.97±0.49b3.420.052羥苯磺酸鈣組150.81±0.090.95±0.09a0.850.022.87±0.422.92±0.25b3.210.055參萸明目合劑組150.81±0.090.92±0.09a0.870.022.67±0.192.65±0.15c2.720.045 F 0.15230.8303.13182.731 P 0.928＜0.0010.080＜0.001 tP

2.7 各組大鼠視網膜免疫組化染色觀察結果

治療10周后空白組大鼠視網膜細胞排列整齊，各層組織無明顯異常，神經節細胞層未見CTGF陽性表達細胞（圖1）。糖尿病模型組視網膜細胞排列紊亂，神經節細胞層組織水腫，內、外核層細胞間明顯水腫、疏松，細胞排列紊亂，CTGF表達呈強陽性，著染呈深棕色，視網膜明顯水腫增厚（圖2）。羥苯磺酸鈣組視網膜細胞排列紊亂，神經節細胞層組織水腫減輕，內、外核層細胞間水腫、疏松，細胞排列紊亂，CTGF表達呈陽性，著染呈棕黃色，視網膜明顯水腫增厚（圖3）。參萸明目合劑組視網膜細胞排列較規則，神經節細胞層、內外核層組織水腫明顯減輕，CTGF表達呈弱陽性，著染呈淺棕黃色（圖4）。

2.8 各組大鼠視網膜HE染色光鏡下觀察結果

治療10周后空白組大鼠視網膜結構完整，各層細胞清晰，細胞排列整齊（圖5）。糖尿病模型組視網膜內表面不平整，內界膜腫脹明顯，表面不平、增厚，有較多視網膜血管內皮細胞突出于內界膜。內外核層水腫，視網膜各層變薄，細胞數量減少且排列紊亂十分明顯，部分血管明顯擴張（圖6）。羥苯磺酸鈣組視網膜結構不規則，內界膜腫脹減輕，內外核層細胞水腫，排列紊亂，部分血管呈擴張趨勢，但未見缺血區及新生血管形成（圖7）。參萸明目合劑組視網膜輕微增厚，視網膜內界膜略腫脹，神經節細胞及內外核層細胞排列較整齊（圖8）。

圖1～4 治療10周后各組大鼠視網膜免疫組織化學法CTGF染色光鏡下觀察結果（×400）。圖1空白組大鼠視網膜細胞排列整齊，各層組織無明顯異常，神經節細胞層未見CTGF陽性表達細胞。圖2糖尿病模型組圖視網膜細胞排列紊亂，神經節細胞層組織水腫，內、外核層細胞間明顯水腫、疏松，細胞排列紊亂，CTGF表達呈強陽性，著染呈深棕色，視網膜明顯水腫增厚。圖3羥苯磺酸鈣組視網膜細胞排列紊亂，內、外核層細胞間水腫、疏松，細胞排列紊亂，CTGF表達呈陽性，著染呈棕黃色，視網膜明顯水腫增厚。圖4參萸明目合劑組空白組視網膜細胞排列較規則，神經節細胞層、內外核層組織水腫明顯減輕，CTGF表達呈弱陽性，著染呈淺棕黃色。

圖5～8 治療10周后各組大鼠HE染色光鏡下觀察結果（×400）。圖5空白組大鼠視網膜結構完整，各層細胞清晰，細胞排列整齊。圖6糖尿病模型組視網膜內界膜腫脹明顯，有較多視網膜血管內皮細胞突出于內界膜。內外核層水腫，視網膜各層變薄，細胞數量減少且排列紊亂十分明顯，部分血管明顯擴張。圖7羥苯磺酸鈣組視網膜結構不規則，內外核層細胞水腫，排列紊亂，部分血管呈擴張趨勢，但未見缺血區及新生血管形成。圖8參萸明目合劑組視網膜輕微增厚，視網膜內界膜略腫脹，神經節細胞及內外核層細胞排列較整齊。

3 討論

糖尿病視網膜病變是一種慢性進展性疾病，該病發展至后期將產生增殖膜，增殖膜的產生與其早期血管病變、各種細胞生長因子的作用密切相關，如不及時進行干預，隨著病程延長，病情將加重，纖維化將發生〔4〕。

CTGF是一種新近發現的細胞因子，被視為轉化生長因1（TGF1）的下游效應介質〔5〕，在創傷修復、組織纖維化進程中起重要作用。近期國外有人發現血管內皮生長因子和CTGF是PDR發生的2個最關鍵的因子〔6〕。正常生理情況下體內的CTGF表達很低或無。但在病理狀況下，如進行性系統性硬化癥、動脈粥樣硬化、腫瘤、糖尿病、器官纖維化、創傷等情況下，成纖維細胞、內皮細胞等多種細胞均可產生CTGF。CTGF在DR發生的前期對視網膜病變的發生發展均具有一定的促進作用。國外研究發現DR患者玻璃體中CTGF濃度升高，導致新生血管形成更活躍〔7〕。CTGF促進新生血管形成及纖維化的機制可能與促進細胞有絲分裂和增生，趨化細胞、誘導細胞粘附以及促進細胞外基質合成有關〔8〕。CTGF在PDR的發生過程中起著一定的促進作用，可能與促進眼新生血管形成及纖維化有關〔9〕。

本研究中，各組大鼠視網膜HE染色及CTGF免疫組化染色結果顯示：正常大鼠視網膜細胞排列整齊，各層組織無明顯異常，神經節細胞層未見CTGF陽性細胞；糖尿病大鼠視網膜明顯水腫，CTGF表達呈強陽性；參萸明目合劑組CTGF的陽性表達及視網膜水腫情況明顯好于羥苯磺酸鈣組和糖尿病模型組。各組大鼠玻璃體CTGF含量測定結果顯示：生理狀態下玻璃體內存在一定量的CTGF，糖尿病大鼠玻璃體CTGF含量明顯增高，參萸明目合劑組明顯低于羥苯磺酸鈣組和糖尿病模型組。研究結果提示，隨著糖尿病視網膜病變的進展，玻璃體CTGF含量和視網膜CTGF的陽性表達呈上升趨勢，與國內同類研究一致〔1〕；而參萸明目合劑可降低玻璃體CTGF含量和視網膜CTGF的陽性表達，并延緩視網膜病變的進展。盡管CTGF并非DR發展過程中唯一的致纖維化因素，但其作用不容忽視，參萸明目合劑可抑制CTGF的陽性表達，對延緩DR病情發展，抑制PDR發生有較好療效。其機理可能與抑制細胞有絲分裂和增生，抑制DR新生血管的形成和纖維化有關。同時，參萸明目合劑對糖尿病大鼠視網膜具有保護作用，可減輕視網膜各層水腫，阻斷視網膜新生血管生長，維持視網膜結構整齊，減輕糖尿病對視網膜的損害。其作用機理可能與參萸明目合劑補益脾腎、活血通絡，可改善視網膜的營養和微循環及減輕視網膜的缺血、缺氧狀態有關。

本研究還觀察到參萸明目合劑可降低血糖和血脂。參萸明目合劑能改善患者眼底，提高視力，考慮與其降血脂、降血糖的功效分不開。另外，參萸明目合劑能降低糖尿病大鼠尿蛋白，療效優于羥苯磺酸鈣〔10〕。參萸明目合劑可以減少早期糖尿病腎病大鼠尿蛋白的排泄，延緩糖尿病腎病的進展。同時，如果用藥劑量合理，參萸明目合劑對大鼠肝功能無損害。

綜上所述，參萸明目合劑能夠抑制糖尿病大鼠視網膜CTGF表達，降低玻璃體CTGF含量，維持視網膜結構的正常，延緩視網膜新生血管生長及視網膜纖維化的發生；同時，參萸明目合劑能降低血糖、血脂、尿蛋白，維持大鼠的體重，對糖尿病腎病及DR的發展起到抑制作用，有較好的臨床應用前景。

［1］Hinton DR，Spee C，He S，et al.Accumulation of NH2-terminal fragment of connective tissue growth factor in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy［J］.Diabetics Care，2004，2（7）：758-764.

［2］張潔.實驗性糖尿病大鼠建模常用方法［J］.臨床與醫療，2011，1（21）：395.

［3］鄭虎占，董澤宏，佘靖.中藥現代研究與應用（第一卷）［M］.北京：學苑出版社，I997，3680-3717.

［4］胡艷濱，張靜楷，孫智勇，等．辛伐他汀對糖尿病大鼠玻璃體及視網膜結締組織生長因子表達的影響［J］.中華眼科雜志，2012，48（5）：444-449.

［5］GrotendorstGR，OkochiH，HayashiN.Anovel transforming growth factor beta response element controlsthe expressionof the connective tissuegrowthfactorgene［J］.CellGrowthDiffe，1996，7（4）：469-480.

［6］Kita T，Hata Y，Kano K，et al.Transforming growthfactor beta 2 and connective tissue growthfactor inproliferative vitreoretinal disease spossible involvement of hyalocytes and the rapeutic potentialof rhokinase inhibitor［J］.Diabetes，2007，56（1）：231-238.

［7］HintonDR，Spee C，He S，et al.Accumulation of NH（2）-terminal fragment of connective tissue growth factor in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy［J］.Diabetes Care，2004，27（3）：758-764.

［8］Yokoi H，Sugawara A，Mukoyama M.Role of connective tissue growth factor in profibrotic action of transforming growth factor：a potential target for preventing renal fibrosis［J］.Am J Kidney Dis，2001，38（4）：134-138.

［9］丁純.糖尿病視網膜病變玻璃體中CTGF，SDF-1的質量濃度測定［J］.國際眼科雜志，2010，10（7）：1314-1315.

［10］董靜，梁翠格，于桂娜，等.羥苯磺酸鈣治療早期糖尿病腎病的療效觀察［J］.山東大學學報，2008，46（1）：80.

Effect of Shenyu Mingmu Heji on expression of CTGF in vitreous and retina of diabetic rats

SHUFengjun，WEI Qiping，LU Shilin，et al.Liaocheng City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Liaocheng 252004，Shandong，China

OBJECTIVE To investigate the influence of Shenyu Mingmu Heji on diabetic retinopathy（DR）rats vitreous CTGF content and the expression of retinal CTGF and the mechanism of action.METHODS Used streptozotocin induced diabetic model.The treatment group was given Shenyu Mingmu Heji，the control group was given calcium dobesilate orally to observe the general expression of rats，weighing，blood glucose，lipid and CTGF in vitreous and retinal CTGF content and conduct immunohistochemical staining and retinal slice.RESULTS Shenyu Mingmu Heji could obviously improve the DR rat survival condition.This medicine could reduce the blood sugar and blood lipid of DR rats，reduce the content of vitreous and the positive expression of retinal CTGF.There was a certain preventive effect on experimental diabetic retinopathy.CONCLUSIONS Shenyu Mingmu Heji could protect the retina effective microvascular，reduce capillary permeability，prevent retinopathy progressed to proliferative phase.

non-proliferative diabetic retinopathy；Shenyu Mingmu Heji；SD rats

R285

A

1002-4379（2015）05-0318-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.003

1山東省聊城市中醫醫院眼科，聊城252004

2北京中醫藥大學東方醫院眼科

3聊城市第三人民醫院眼科

韋企平，Email：wei_dfyy@163.com