中藥蟬花菌株篩選及發酵條件優化研究

陳顯群，羊 悅，楊勝利*

（1.溫州市食品研究所，浙江溫州325000；2.浙江工業大學藥學院，浙江杭州310014）

中藥蟬花菌株篩選及發酵條件優化研究

陳顯群1，羊 悅2，楊勝利2*

（1.溫州市食品研究所，浙江溫州325000；2.浙江工業大學藥學院，浙江杭州310014）

目的：從蟬花中分離真菌，并采用液體培養考察菌絲收率。方法：在單因素實驗基礎上，利用正交實驗設計，對蟬花菌液態深層發酵條件如搖床轉速、接種量、pH等進行了優化。結果：最優的發酵工藝為初始pH 7.0、搖床轉速160 r/min、發酵溫度25℃。結論：優化發酵工藝條件下蟬花菌發酵生物量為6.57 g/L。

蟬花；液態深層發酵；分離

0 引言

蟬花屬蟲生性藥用真菌，是我國傳統名貴中藥材，又名蟬蛹草、蟬茸、胡蟬、蜩等，與冬蟲夏草同屬于菌物界、真菌門、子囊菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，具有廣泛的生物活性。中醫藥學家認為，蟬花具有疏散風熱、透疹、熄風止痙、明目退翳之功效。現代醫學研究表明，它具有免疫調節[1-3]、抗疲勞抗衰老[4-5]、抗腫瘤[6-8]、改善腎功能[9]、促進造血功能[10]、鎮靜催眠[11]、滋補強壯[12]等作用。由于蟬花與冬蟲夏草同屬蟲菌復合體，且具有相近的藥用價值，所以醫家常將蟬花作為冬蟲夏草的代用品。由于蟬花生長需要特定的生態環境和寄主昆蟲，資源稀少，再加上長期采挖，資源日趨枯竭。開展人工分離、培養及液體發酵培養菌絲體的研究是未來的一個發展方向。近些年對冬蟲夏草的研究較多，而對蟬花的研究甚少，蟬花具有與冬蟲夏草相似的化學成分，故蟬花可能具有與冬蟲夏草相似的藥用價值，從而為蟬花作為冬蟲夏草的替代品提供了理論依據[13-16]。

1 材料與方法

1.1 蟬花采自浙江安吉竹博園

1.2 培養基

分離培養基:馬鈴薯20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂粉2%。121℃滅菌20 min。

種子培養基:馬鈴薯20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%。121℃滅菌20 min。

液體發酵培養基:馬鈴薯提取液20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.4%，MgSO40.05%，K2HPO40.1%，酵母膏0.2%，維生素B1 0.002%。121℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

稱取5 g天然蟬花樣品，分別取自僵蟲體、子座芽和孢子，加入到45 mL無菌生理鹽水中，振蕩30 min。梯度稀釋，從各稀釋液中吸取0.1 mL到篩選平板并涂布，置于25℃恒溫培養箱中培養3～5 d。挑選單個典型的菌落，接種到PDA斜面培養基中，保存備用。

1.3.2 菌種鑒定

用點接法將蟬花真菌接種到PDA平板上進行菌落形態觀察，通過顯微鏡作個體形態觀察。

1.3.3 種子培養

250 mL搖瓶裝液量50 mL，接種斜面菌塊，置于搖床中，轉速160 r/min，25℃培養4 d。

1.3.4 發酵培養條件的影響

經初步試驗選定pH值、發酵溫度、搖床轉速作為主要影響因素，以發酵后菌絲體生物量為指標，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平正交設計試驗，對蟬花菌株發酵條件進行優化研究。

1.3.4.1 pH值的影響

在250 mL錐形瓶中裝入100 mL發酵培養基，按5%種子液接種，pH值分別調至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，25℃培養5 d，發酵結束后，4000 r/min離心，測定菌絲體量。

1.3.4.2 溫度的影響

固定其他條件，考查發酵培養溫度分別為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃時對蟬花發酵生物量的影響。

1.3.4.3 搖床轉速的影響

固定其他條件，考查搖床轉速分別為120、140、160、180、200 r/min時對蟬花發酵生物量的影響。

1.3.4.4 正交設計優化

針對發酵過程中pH值、溫度和轉速對菌絲體生長的影響，選定這3個因素，進行正交實驗L9（33），其因素和水平見表1。

表1 發酵條件因素水平表Table 1 Factors and levels of fermentation condition

1.3.5 生物量測定

采用干重法。發酵液經4000 r/min離心15 min去除上清液，菌絲體用去離子水洗滌3次后離心，置于烘箱內60℃烘干至恒重后稱重。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離與鑒定

按照1.3.1方法分離出多株菌株，其中在子座芽中分離的一株長勢良好。經分離純化后，點接在PDA平板中觀察該菌落形態。發現剛開始菌落圓形呈白色，起初星狀放射生長、菌絲平伏，與培養基結合緊密，不易挑取，繼續培養顏色逐漸加深，最終呈紫色。在顯微鏡下觀察該菌個體形態，發現菌絲有隔，基部無足細胞。分生孢子梗生于氣生菌絲上，具簡單分枝，由單側生、對生的瓶狀小梗組成。瓶梗較短，基部膨大和具管狀的頸部，可初步判定其為蟬擬青霉。

2.2 發酵條件對蟬花菌絲體生長的影響

2.2.1 pH值對蟬花發酵生物量的影響

一般來講，pH值過低菌體易衰老，pH值過高易使菌體自溶。本實驗研究了不同的培養基pH值對菌體生長的影響，結果如圖1所示。由圖1可以看出，就生物量而言，出發菌株隨著初始pH值的升高出現先上升后下降的變化，在初始pH為7.0時，達到最大值；在初始pH為6.5和pH為7.0時生物量變化不明顯，分別是6.24 g/L和6.27 g/L。

圖1 培養初始pH值對生物量的影響Fig.1 Effects of initial pH on biomass

圖2 培養溫度對生物量的影響Fig.2 Effects of culture temperature on biomas

2.2.2 培養溫度對蟬花發酵生物量的影響

對微生物發酵培養來說，溫度的影響是雙方面的:溫度升高，可以加快微生物的生長，但是隨著溫度的上升，細胞中對溫度敏感的酶可能會遭到破壞，而且溫度過高，菌體易老化，影響到菌絲體生長及其他代謝產物的積累。一般的較適于真菌生長的溫度范圍為25℃～30℃，據報道菌絲在10℃～30℃下均能生長。本實驗選擇溫度范圍在20℃～30℃之間，考察對菌絲體的生長影響。由圖2可以看出，在26℃時的生物量最大，而低于20℃或高于30℃對菌絲體的生物量影響較大，由于長勢肉眼便可直觀辨別，因此沒有進一步研究的必要。因此選定蟬花菌絲生長的最適合的發酵溫度為26℃，菌株生物量達到最大值6.42 g/L。

2.2.3 搖床轉速對蟬花發酵生物量的影響

由表3可以看出，搖床轉速為160 r/min時蟬花菌絲生物量達到最大，菌絲在液體中生長需要消耗氧氣，隨著搖床轉速的提高，液面接觸空氣的面積增大，利于溶解氧水平的增加；搖床轉速繼續增加，剪切力增加，菌絲不斷被切斷，形成新的菌絲球萌發點，從而生長出新的菌絲球；但搖床轉速過大，菌絲難以在高速振蕩情況下會導致菌絲損傷嚴重，難以維持正常的生長，因而影響整個生物量，所以搖床轉速以160 r/min左右為宜。

圖3 藥瓶轉速對生物量的影響Fig.3Effects of shaking speed on biomass

2.2.4 pH值、溫度、搖床轉速正交試驗

為考察不同發酵條件對菌絲體生長的影響，在單因素試驗基礎上，試驗選pH值、溫度、轉速等3因素，進行L9（33）正交試驗，在參考已知文獻及前期試驗的基礎上，以生物量為評價指標，優化液態深層發酵工藝。按照表1設計的正交實驗，考察了不同發酵條件對蟬花菌絲體的生長的影響，結果示于表2。由此得出優選實驗方案為A2B2C2。搖床轉速與溶氧濃度有關。溶氧對菌絲體生長有影響。由于氧在水中的溶解度很小，因此氧往往成為發酵過程的限制性因素。搖床轉速慢，氧在發酵液中的溶解度就小，在發酵進入對數期后，易造成溶氧不足，影響了菌絲體的生長；搖床轉速快，增加了溶氧量。溫度對菌絲體的生長具有重要影響，25℃時菌絲體生長迅速，最后得到的生物量高。pH影響代謝過程中各種酶的活性，pH=7.0有利于菌體的生長。

表2 冬蟲夏草液態深層發酵正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment design in submerged fermentation conditions of Cordyceps sinensis

表3 方差分析Table 3Analysis of variance

從以上的方差分析可知，各因素對蟬花菌絲體生成量的影響大小順序為A（溫度）＞B（pH）＞C（轉速），三個因素對結果的影響有統計學意義。最終確定冬蟲夏草菌絲體的富硒量的最佳工藝條件為A2B2C2，即pH值為7，溫度25℃，轉速為160 r/min。

2.3 最佳工藝驗證試驗

在單因素和正交試驗優化的基礎上，進行驗證試驗。結果表明，在培養5 d的條件下，蟬花菌液態深層發酵最優工藝參數：裝液量100 mL，pH值7.0，搖床頻率為160 r／min，溫度25℃。此時蟬花發酵生物量為6.57 g／L。

3 結論

通過對蟬花菌絲體發酵條件的優化研究，發現其工藝的優化是一個非常復雜的動態過程，影響其結果的因素也很多，通過單因素試驗和正交試驗取得了較好的效果，結合方差分析得到反應條件的最佳點，在此條件下，蟬花發酵生物量為6.57 g／L。本試驗找出了蟬花菌絲的最佳發酵條件，為以后的研究提供了一定的基礎，今后可進一步選育出優良的蟬花菌株應用到發酵生產中。

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Study on Separation and Fermentation Culture of Strain of Cordyceps Cicadae

CHEN Xian-qun1,YANG Yue2,YANG Sheng-li2
（Wenzhou Food Research Institute,Wenzhou，Zhejiang 325000,China；The College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou，Zhejiang 310014,China）

Objective:The strain isolated from Cordyceps cicadae and its fermentation culture were studied,mycelia yield was investigated by submerge fermentation.Methods:Single factor examination and orthogonal experiment design were used to investigate the effects of pH,temperature,shaking speed on the biomass of the Cordyceps cicadae.Results:The optimal fermentation conditions:initial pH 6.0,shaking speed 160 r/min,fermentation temperature 25℃.Conclusion:The biomass of Cordyceps cicadae is 34.98 g/L under the optimized fermentation process.

Cordyceps cicadae;submerged fermentation;isolation

1006-4184（2015）2-0018-04

2014-07-04

陳顯群（1965-）,男，高級工程師，研究方向為食品營養。E-mail：wzspyjs@163.com。

*通訊作者：楊勝利（1972-）,男，副教授，博士，研究方向為微生物制藥。E-mail：yangshengli01@zjut.edu.cn。