云煙87八倍體植株的誘導及其主要生殖特征

趙申清玉，黨江波，梁國魯，向素瓊，郭啟高，張艷

1西南大學園藝園林學院，重慶北碚，400716；2中國煙草總公司重慶市公司煙草研究所，重慶北碚，400716

云煙87八倍體植株的誘導及其主要生殖特征

趙申清玉1，黨江波1，梁國魯1，向素瓊1，郭啟高1，張艷2

1西南大學園藝園林學院，重慶北碚，400716；2中國煙草總公司重慶市公司煙草研究所，重慶北碚，400716

通過不同濃度秋水仙素溶液浸泡“云煙87”四倍體無菌苗莖尖72 h，經組織培養，成功獲得八倍體植株，其中以0.4%濃度秋水仙素處理檢出率最高，為28.57%。與“云煙87”四倍體植株相比，八倍體植株花器官明顯較大，葉片較厚、較小，節間較短。八倍體植株花粉量小，花粉大小不均一，可見超大花粉，花粉萌發率低，僅為6.45%。八倍體自交不能結實，但與四倍體煙草品種雜交均可獲得大量有活力的種子，發芽率均大于65%，且與同“云煙87”四倍體雜交不能獲得種子的野生煙草Nicotianaplumbaginifolia雜交也可獲得有活力的種子。可見，通過秋水仙素浸泡結合組織培養獲得煙草八倍體是可行的。

云煙87; 八倍體; 六倍體; 種子

部分植物多倍體以其器官巨大、生長快速、無籽、有效成分含量高、對逆境的適應能力強等特性在育種中得到廣泛應用[1-3]。其中三倍體、四倍體見較多報道，尤其是在一些能單性結實的果樹以及以營養器官為主要產物的植物，如香蕉[4]、柑橘[5]、楊樹[6]、甜菜[7-8]、丹參[9]、青蒿[10]中的應用較具前景。部分大面積推廣的三倍體甜菜、西瓜即為四倍體與二倍體雜交而成，這種方法近來亦被用于三倍體丹參的培育[11-12]。

煙草為異源四倍體物種，其具明顯的二倍化特征[13-14]。因此，煙草八倍體可能具有與普通二倍體物種的四倍體材料相似的特征，其與四倍體煙草雜交可能會獲得大量六倍體煙草。由于在煙草生產及研究中，四倍體是主要材料，八倍體的研究僅零星見于少數文獻[15-17]，其相關特征也不甚明晰。因此，對煙草八倍體的相關特性，特別是生殖相關特性進行研究，一方面有利于拓展煙草研究的范圍，另一方面也有利于后續利用煙草八倍體創制煙草六倍體植株。八倍體材料在煙草育種中并不常用，因此染色體加倍在處理四倍體煙草中少見報道[15-17]。植物染色體加倍的方法較多，其中以秋水仙素溶液誘導最為常用[18]，在構建煙草DH系材料中經常使用[19]。本試驗在組織培養條件下采用秋水仙素誘導獲得八倍體煙草植株，并對其主要生殖特征進行了觀察與研究。為后續利用煙草八倍體培育煙草六倍體提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

“云煙87”四倍體無菌苗，“云煙87”四倍體、“Florida301”四倍體、“Beinhart1000-1”四倍體、“L-8”四倍體、N.plumbaginifolia二倍體（種子由國家煙草中期庫提供）植株。所有材料均種植于西南大學重慶市果樹學重點實驗室試驗基地。

1.2 方法

八倍體誘導：參考劉仁祥等[20]的報道采用秋水仙素浸泡法，于無菌操作臺上小心切取“云煙87”四倍體無菌苗莖尖，放入0.0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%的秋水仙素無菌溶液中，72小時后取出，無菌水清洗5遍，后將其接種于MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中，約30 d后將不定芽轉入MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中，繼代3次。

染色體數目鑒定：待第3次繼代的幼苗長至5-7葉時取幼嫩葉片，于0.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液中處理4 h，去壁低滲火焰干燥法制片[21]。

八倍體形態觀察：獲得的八倍體植株經組織培養擴繁生根（生根培養基為：1/2MS+2.0mg/L IBA）后種植于田間，觀察、測定花器官形態，花粉形態，以“云煙87”四倍體為對照。

花粉活力測定：花粉活力的測定采用離體萌發法。參考謝朝添等的[22]方法配制煙草花粉離體萌發培 養 基：0.01% KH2PO4，0.01% CaCl2，0.01% H3BO3和 15% 蔗糖。25℃培養 4 h 后顯微鏡下觀察，以花粉管長度大于花粉粒直徑作為萌發標準，統計花粉萌發率，以“云煙87”四倍體為對照。

雜交：以“云煙87”四倍體、八倍體為母本，與“云煙87”四倍體、“Florida301”四倍體、“Beinhart1000-1”四倍體、“L-8”四倍體、N.plumbaginifolia二倍體進行雜交，每個雜交組合20-50個蒴果，記錄坐果率。蒴果成熟后，收集種子，去除雜質，干燥保存。

種子活力測定：將雜交獲得的種子分散于濕潤濾紙上，置于25℃環境中，保濕，10 d后統計發芽率。

1.3 統計分析

“云煙87”四倍體、八倍體花器官形態、花粉形態數據采用excel軟件計算平均值及標準差，t檢驗檢測四倍體與八倍體間的差異水平。

2 結果與分析

2.1 八倍體的誘導

“云煙87”組培苗幼芽經不同濃度的秋水仙素無菌溶液浸泡72 h后，在增殖培養基上均能形成愈傷組織，部分愈傷組織褐化嚴重。部分材料在25 d后分化出不定芽，待芽長至2.0-2.5 cm時轉至壯苗培養基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）中，經3次繼代，取幼葉檢測。

檢測結果發現，不同濃度秋水仙素溶液浸泡處理后的莖尖分化出的幼苗大部分仍為四倍體；少部分為八倍體（圖1，表1）；極少部分倍性大于8x，由于染色體數目過多，無法判定其倍性；部分幼苗為4x和8x混倍體。其中，經0.4%秋水仙素溶液誘導并增殖獲得的無菌苗中檢出8x的比例最大，為28.57%。

表1 秋水仙素誘導后不同倍性材料檢出率Tab.1 Detection rates of plants with different ploidy induced by colchicine

2.2 八倍體形態特征

圖1 “云煙87”八倍體植株（A、B）及其染色體數目（2n=8x=96）（C）Fig.1 Yunyan87 octoploid plants (A, B) and chromosomes thereof (2n=8x=96) (C)

八倍體植株較矮、節間較短，葉片較小但肥厚。其發育期明顯長于“云煙87”四倍體，2014年統計其現蕾時間較四倍體晚近1個月。八倍體花器官長度、直徑，花藥長，子房直徑、長度，花柱長度以及柱頭直徑明顯大于四倍體（圖2，表2）。

圖2“云煙87”八倍體（左）與四倍體（右）花器官形態（A，花；B，去部分花冠的花；C，子房、花柱；D，花藥）Fig.2 Flower of Yunyan87 octoploid and tetraploid plants (A, fl ower; B, fl ower without corolla; C, ovary and style; D, anther)

表2 “云煙87”四倍體與八倍體花器官形態對比Tab.2 Comparison between “Yunyan87” tetrploid and octoploid fl owers

八倍體花粉量極少，且不均勻，大部分為空癟形態（圖3）。八倍體花粉平均直徑為36.17±10.37 μm，可見超大花粉，其直徑最大可達72.53 μm。四倍體花粉則較為均勻，最大花粉直徑為45.26 μm，最小花粉直徑為28.32 μm，平均直徑為35.72±1.57 μm。

圖3 “云煙87”四倍體（A）與八倍體（B）花粉形態（200×）Fig.3 Pollen of Yunyan87 tetraploid (A) and octoploid (B) under optical microscope

2.3 八倍體的花粉活力及結實性

經離體萌發試驗顯示，“云煙87”四倍體花粉萌發率達58.76%，而八倍體花粉萌發率僅6.45%（圖4）。

圖4 “云煙87”四倍體（A）和八倍體（B）花粉萌發情況（100×）Fig.4 Pollen germination of Yunyan87 tetraploid (A) and octoploid (B)

“云煙87”八倍體作母本與“云煙87”、“Florida301”、“Beinhart1000-1”、“L-8”4個煙草品種的四倍體及野生煙草N.plumbaginifolia二倍體雜交均能正常坐果。除野生煙草雜交坐果率僅為68.00%外，四倍體煙草品種雜交的坐果率均為100.00%，而野生煙草二倍體與“云煙87”四倍體雜交、八倍體自交未能獲得成熟蒴果。

圖5“云煙87”四倍體自交（A）種子及云煙87八倍體與四倍體雜交的種子（B）Fig.5 Seeds of Yunyan87 tetraploid sel fi ng and Yunyan87 octoploid cross with tetraploid

八倍體的種子較四倍體種子大（圖5），大部分可萌發，萌發率在56.67%-80.17%之間，而“云煙87”四倍體種子的萌發率均在90%以上（表3）。

表3 “云煙87”八倍體雜交坐果率與種子發芽率Tab.3 Fruit setting rates and seeds germination rates of Yunyan87 octoploid's hybridization

3 結論

綜上所述，通過秋水仙素溶液浸泡誘導煙草染色體加倍是可行的，“云煙87”八倍體自交不能結實，但作母本可與多個四倍體煙草品種雜交并獲得大量有活力的種子，且倍性增加使“云煙87”與野生煙草N.plumbaginifolia的雜交親和性增加，獲得了有活力的種子。這將為后續六倍體煙草及倍半二倍體煙草的培育提供了可能性。

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Induction of Yunyan87 octaploid plants and main reproductive characters thereof

ZHAO Shenqingyu1, DANG Jiangbo1, LIANG Guolu1, XIANG Suqiong1, GUO Qigao1, ZHANG Yan2
1 College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing, 400716, China；2 Tobacco Research Institute of Chongqing Municipal Tobacco Company, Chongqing, 400023, China

Yunyan87 octoploid plants were obtained from stem tips of Yunyan87 tetraploid aseptic seedlings, which were soaked in colchicine of different concentrations for 72h.The highest induction rate was 28.57% which occuredin the concentration of 0.4%.Compared to tetraploid, the octaploid floral organ was bigger with thicker and smaller leaves as well as shorter internodes.Pollens in octoploid plants’ anther had different sizes.Octoploid plants’ pollen germination rate was only 6.45%, and no seed on selfing was found.However, a large number of viable seeds were obtained when octoploid plants crossed with tetrploid tobacco, and germination rate exceeded 65%.Viable seeds in cross of octoploid ×N.plumbaginifoliacould be acquired while those in cross of tetraploid ×N.plumbaginifoliacould not.Results showed that octaploid tobacco can be obtainable from colchicine induction and tissue culture.

Yunyuan87; octaploid tobacco; hexaploid tobacco; seed

趙申清玉，黨江波，梁國魯,等.云煙87八倍體植株的誘導及其主要生殖特征[J].中國煙草學報，2015,21（5）

重慶山地特色優質抗病烤煙新品種選育（2012044）

趙申清玉（1988—），碩士研究生，研究方向：細胞遺傳，Email：sophie_zsqy@163.com

梁國魯（1960—），博士，研究員，研究方向：細胞遺傳，Email：lianggl@swu.edu.cn

2014-09-22

:ZHAO Shenqingyu, DANG Jiangbo, LIANG Guolu, et al.Induction of Yunyan87 octaploid plants and main reproductive characters thereof [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(5)