湖南省部分地區棉田牛筋草(Eleusineindica)對精喹禾靈的抗性

宗 濤, 李 潔, 劉祥英, 柏連陽

(1.湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 湖南省農業科學院, 長沙 410125)

?

湖南省部分地區棉田牛筋草(Eleusineindica)對精喹禾靈的抗性

宗 濤1, 李 潔1, 劉祥英1, 柏連陽2*

(1.湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 湖南省農業科學院, 長沙 410125)

采用整株法測定了湖南省部分地區棉田牛筋草(Eleusineindica)對精喹禾靈的抗性水平,還測定了精喹禾靈對牛筋草抗(R)、感(S)種群體內GSTs及SOD、POD、CAT影響的差異。整株法測定結果顯示,相對于敏感的南縣種群,其他地區棉田牛筋草對精喹禾靈的抗性指數在1.6～9.7之間,其中湘陰種群最高為9.7,澧縣種群最低為1.6;精喹禾靈處理2 d后,R種群GSTs活性急劇上升,在第3天達到最高,隨后急劇下降,5 d之后趨于平緩。S種群GSTs活性在施藥后先上升后下降。藥劑處理后,R種群的SOD和POD活性在中期顯著低于S種群,R、S種群的CAT活性在藥后第9天有明顯差異。結果表明,R種群對精喹禾靈產生抗性的原因可能是GSTs對精喹禾靈的代謝作用加強,抗氧化酶系活性的變化可能與抗性相關。

牛筋草; 精喹禾靈; 抗藥性

ACCase抑制劑類藥劑的作用位點單一,抗藥性產生較快。自第一例抗ACCase抑制劑類除草劑禾草靈(diclofop-methyl)的瑞士黑麥草(Loliumrigidum)在澳大利亞出現后[3],抗ACCase抑制劑類除草劑的雜草先后在英國、澳大利亞、德國、法國和瑞士等國發現,至今已在36個國家發現46種抗ACCase制劑類除草劑的雜草生物型[4]。國外關于牛筋草對ACCase抑制劑類的抗性已有一些報道。Leach等報道了牛筋草對ACCase抑制劑類除草劑產生抗性是由靶標酶位點突變產生[5]。Vidal等報道了巴西大豆田的牛筋草對ACCase抑制劑類除草劑產生了抗性[6]。Osuna等報道了牛筋草對ACCase抑制劑類除草劑產生抗性,并發現了一個突變位點[7]。我國已報道日本看麥娘(AlopecurusjaponicasSteud.)、棒頭草(PolypogonfugaxNeesexSteud.)、菵草[Beckmanniasyzigachne(Steud.)Fernald]對 ACCase抑制劑類產生抗性[8-10],但牛筋草對該類除草劑的抗性仍然未見報道。

靶標抗性和非靶標抗性是雜草對除草劑產生抗藥性的兩大類。非靶標抗性大多抗性水平不高,是指植物通過提高對除草劑的軛和作用、降解作用以及清除除草劑產生的有毒代謝產物的解毒能力,從而對除草劑產生的抗性[11]。谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione s-transferase,GSTs)是雜草對除草劑通過解毒作用產生非靶標抗性的關鍵酶,對于大部分除草劑在雜草體內的代謝有著重大作用[12]。研究顯示雙子葉雜草苘麻(Abutilontheophrasti)對莠去津(atrazine)的抗性和小子草(Phalarisminor)對異丙隆的抗性均是由于增強代謝導致[13]。Hall等研究表明英國種群的鼠尾看麥娘(Alopecurusmyosuroides)對精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl)和禾草靈(diclofop-methyl)的抗性,在一定程度上是鼠尾看麥娘對這兩種除草劑的代謝增強所致[14]。除草劑是一種非生物逆境,植物體內的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)可以降低干旱、低溫、病、蟲、鹽堿及澇害等逆境對植物造成的危害[15-17]。Pyon 等研究結果顯示,抗氧化酶系活性提高和還原型谷胱甘肽含量升高可能是小飛蓬(Erigeroncanadensis)對草甘膦產生抗性的原因之一[18]。但Zabalza 等研究表明氧化脅迫作用與豌豆(PisumsativumLinn.)對乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類除草劑產生的耐藥性無關[19]。本文以抗性及敏感牛筋草為試材測定SOD、POD、CAT活性,為明確牛筋草抗性與氧化脅迫之間的關系,豐富雜草抗性理論,以及牛筋草的抗性治理提供科學依據。

本研究中試驗材料采自湖南省洞庭湖周邊的益陽、岳陽、常德三大棉區,試驗選用整株測定法,檢測了牛筋草對精喹禾靈的抗性水平,通過研究施藥后代謝酶(GSTs)、抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)]的變化,首次探討了牛筋草對精喹禾靈的抗性機制。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試藥劑：50g/L精喹禾靈(quizalofop-P-ethyl)乳油,日本日產化學工業株式會社;硝酸鉀(KNO3),國藥集團化學試劑有限公司;還原型谷胱甘肽(GSH),Solarbio公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40),Sigma公司。

供試種子：2012年8月從湖南省部分地區連續使用精喹禾靈6～10年左右的棉田,采集到10個牛筋草種群。在南縣未施過藥劑的荒山中采集到相對敏感牛筋草種群。采集地點見表1。

絲黑穗病：播前種子處理，用藥劑處理種子是綜合防治中不可忽視的重要環節。方法有拌種、浸種和種衣劑處理三種。藥劑防治必須選擇內吸性強、殘效期長的農藥，三唑類殺菌劑拌種防治玉米絲黑穗病效果較好，大面積防效可穩定在60%～70%。

試驗儀器：3WPSH-500D型生測噴霧塔,農業部南京農業機械化研究所;DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋,天津泰斯特儀器有限公司;UVmini-1240型紫外分光光度計,島津國際貿易(上海)有限公司;X-22R高速冷凍離心機,貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 整株測定法

取破除穎殼后的牛筋草種子,用0.125%的KNO3溶液浸泡24 h。在面積為100 cm2的塑料盆中,裝入泥土與營養土2∶1混配的土壤,澆灌2次,使土壤完全濕潤。將種子均勻撒到盆中,每盆約30粒,覆蓋一層薄砂,再次澆水,使牛筋草種子與土壤充分接觸,置于室外培養。2～3葉期時對牛筋草進行間苗,選取長勢一致的牛筋草15株。于牛筋草4～5葉期,使用3WPSH-500D型生測噴霧塔進行莖葉噴霧。精喹禾靈有效劑量設置為0、3.75、7.5、15、30、60 g/hm2,所有梯度均設3個重復。施藥后14 d,稱量牛筋草地上部分鮮重,采用毒力回歸方程y=a+bx,經SPSS(19.0)軟件得出GR50。y為特定除草劑用量下所測雜草的抑制率的幾率值,x為除草劑用量的對數,GR50為除草劑對牛筋草的生長抑制中量。敏感種群選用南縣牛筋草,根據公式計算得出各地區的抗藥性指數(resistance index,RI)。

取南縣牛筋草為敏感(S)種群,湘陰牛筋草為抗性(R)種群。于牛筋草的4～5葉期,用133.33 g/hm2的精喹禾靈進行莖葉噴霧,設清水為對照。施藥后第1、2、3、5、7天剪取牛筋草地上部分。試驗參照吳進才等的方法改進[20],稱取樣品0.5 g,置于預冷的研缽中,加入8 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(含還原型谷胱甘肽25 mmol/L,5%PVP,pH 8.0)后冰浴研磨至勻漿,于4 000 r/min離心15 min。取上清液后,于10 000 r/min再離心10 min,得到上清液作為酶提取液(上述操作在-4℃下進行)。試驗參照吳進才[20]、韓瑞娟[21]等的方法,在3 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液中(pH 8.0)中加入0.1 mL酶液,于水浴鍋中25℃恒溫10 min,再加入13 mmol/L CDNB(由0.1 mL無水乙醇配制),反應10 min后,置于分光光度計340 nm處測得A值。用摩爾消光系數9.5 mmol/(L·cm)來計算樣品的蛋白活性。蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法。試驗平行測定3次。

蛋白活性=1 000*A/(C*9.5)

其中A為吸光度值,C為稀釋后樣品的蛋白濃度mg/mL,蛋白活性單位為nmol/(min·mg)。

GSTs的相對活性為處理樣品的GSTs活性與同期CK樣品活性的比值。

1.2.3 超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫活性測定

取南縣牛筋草為敏感(S)種群,湘陰牛筋草為抗性(R)種群。于牛筋草的4～5葉期,用133.33 g/hm2的精喹禾靈進行莖葉噴霧,設清水為對照。施藥后第1、5、9、14天剪取牛筋草地上部分。參照Wang等、Aebi的方法[22-24]。稱取牛筋草地上部分0.5 g,剪碎放入預冷的研缽中,加入5 mL 50 mmol/L預冷的磷酸緩沖液(PBS,pH 7.8)冰浴勻漿,離心20 min(4 ℃,12 000 r/min),取上清液置于-80℃冰箱待用。采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行蛋白含量和酶活性測定。

1.3 數據處理

數據處理選用軟件SPSS(19.0)。得出不同地區牛筋草種群對精喹禾靈的線性回歸方程、GR50、95%置信限及相關系數r。作圖軟件使用Sigmaplot(10.0)。

2 結果與分析

2.1 整株測定法

結果見表1。對照為南縣的敏感牛筋草種群,各地區牛筋草種群均已對精喹禾靈產生不同程度的抗性,抗性指數在1.6～9.7之間。其中湘陰種群的抗性水平最高,其次是漢壽、大通湖、沅江種群。

表1 不同棉田牛筋草種群對精喹禾靈的抗性水平1)

1) S為敏感種群,R為潛在抗藥性種群；抗藥性指數(RI)=GR50(R)/GR50(S)。

S, susceptible population; R, potential resistant population; Resistance index(RI)=GR50(R)/GR50(S)

2.2 精喹禾靈對敏感及抗性種群牛筋草GSTs活性的影響

抗性牛筋草種群在藥劑處理前的GSTs活性為121.31 nmol/(min·mg),敏感牛筋草種群則為74.18 nmol/(min·mg),抗性種群GSTs活性高于敏感種群。圖1中相對活性結果均為各天施藥后GSTs活力/抗性或敏感種群空白對照GSTs活力。結果顯示,精喹禾靈133.33 g/hm2處理2 d后,抗性牛筋草種群GSTs活性急劇上升,在第3天達到最高,隨后急劇下降,5 d之后趨于平緩。敏感種群GSTs活性在施藥后1 d開始上升,2 d之后開始下降,第3、5天基本無變化,隨即又上升。抗性種群在第2、3、5、7天的GSTs活性波動較大,變化急劇;敏感種群GSTs活性波動較小,變化相對平緩,說明抗性種群受藥劑的影響較大。

圖1 抗性及敏感種群莖葉組織GSTs活性變化Fig.1 The activity variation of GSTs in resistant and susceptible plants

圖2 抗性及敏感種群莖葉組織SOD活性變化Fig.2 Changes in SOD activity in leaf and shoot extracts of resistant (R) and susceptible (S) Eleusine indica

2.3 精喹禾靈對敏感及抗性種群牛筋草SOD、POD、CAT活性的影響

圖2結果顯示,用133.33 g/hm2精喹禾靈處理牛筋草后,抗性種群和敏感種群SOD活性變化在14 d內沒有顯著性差異。但敏感種群的SOD相對活性均高于同期的抗性種群,且在第5、9、14天有顯著性差異。

圖3結果顯示,用133.33 g/hm2精喹禾靈處理牛筋草后,抗性種群和敏感種群POD活性變化在14 d內均沒有顯著性差異,但抗性種群的POD相對活性均低于同期敏感種群,且在第5、9天有顯著性差異。

圖3 抗性及敏感種群莖葉組織POD相對活性變化Fig.3 Changes in POD activity in leaf and shoot extracts of resistant (R) and susceptible (S) Eleusine indica

圖4 抗性及敏感種群莖葉組織CAT相對活性變化Fig.4 Changes in CAT activity in leaf and shoot extracts of resistant (R) and susceptible (S) Eleusine indica

植物體內的過氧化氫酶可以清除過氧化氫,是植物體內酶促防御系統的重要部分。植物組織中CAT活性和H2O2含量與植物自身的抗逆性緊密關聯。CAT試驗結果見圖4。用精喹禾靈133.33 g/hm2處理牛筋草后,第9天敏感種群CAT活性顯著性下降,達到最低,而抗性牛筋草種群CAT活性達到峰值,且與敏感牛筋草種群CAT有顯著性差異。敏感種群CAT活性在第14天有顯著性上升。第1、5、14天抗性與敏感種群CAT活性沒有顯著性差異。

3 討論

Gressel對稻田除草劑抗性風險進行分級,參考了除草劑的作用靶標、選擇壓、持效期、使用歷史等。馬曉淵綜合國內實際情況,對國內水旱田常用除草劑的抗性風險進行了分級,其中ACCase抑制劑類除草劑屬于高風險級別[25],報道一般連續使用6～10年就會產生抗性[26]。整株法測定結果表明：湖南省部分地區棉田牛筋草已對精喹禾靈產生不同程度的抗性,其中,湘陰牛筋草種群抗性水平相對較高,當地使用精喹禾靈防除棉田雜草已將近10年,在長期的選擇壓力下產生了抗性,這與當地反映采用精喹禾靈防除牛筋草失效的情況相一致。未采取除草劑的混用和輪用措施的情況下,農戶若繼續增大精喹禾靈用藥量和用藥次數,則會使該藥劑對牛筋草選擇壓力繼續增加,導致抗藥性迅速發展,增加抗性風險。要制定合理的化學防除方案,首先必須明確各地棉田牛筋草對除草劑的抗性水平。本研究針對湖南省洞庭湖棉區益陽、岳陽、常德的棉田牛筋草進行了抗藥性水平測定,今后應當進一步擴大疑似抗性牛筋草種群的采集區域。

本研究中的湘陰抗性種群牛筋草和南縣敏感種群牛筋草的GSTs活性存在較大的差異,施用藥劑后,抗性和敏感種群GSTs活性在前期均有顯著性上升,但在第2～7天內,抗性種群GSTs相對活性受藥劑影響大,有顯著性變化,而敏感種群GSTs相對活性變化趨勢不明顯。試驗表明,牛筋草對精喹禾靈的抗藥性與GSTs活性密切相關。牛筋草對精喹禾靈產生抗性的重要原因之一就是GSTs對精喹禾靈代謝能力的提高。Western blot研究結果顯示看麥娘體內GSTs活性增強與ACCase的軛合使噁唑禾草靈被解毒,從而導致了看麥娘對噁唑禾草靈產生抗性[27]。研究指出在鼠尾看麥娘的敏感生物型中發現了比抗AOPP類除草劑生物型中更低的GSTs活性[27-28]。

許長成等比較了兩個水稻品種,敏感品種‘桂朝2號’比抗百草枯品種‘Lemont’比具有較低的抗逆活性[29]。吳進才等研究認為水稻葉鞘中SOD活性的變化反映了水稻植株對除草劑的抵御能力[30]。Choudhary等研究顯示受到重金屬脅迫的藻青菌(Spirulinaplatensis-S5)SOD活性顯著上升,認為是藻青菌的一種自我保護反應[31]。抗性種群與敏感種群的CAT活性差異在第9天達到最大,可能是抗性種群受到藥劑脅迫后,啟動自身保護系統避免受到傷害。植物抗氧化酶系活性的提高是抵抗逆境的方式之一,而本研究中藥劑處理之后,抗性種群SOD相對活性在第5、9、14天顯著低于敏感種群,POD相對活性第5、9天顯著性低于敏感種群,與前人研究相悖,SOD和POD活性變化對牛筋草抗性的產生是否有影響,還有待于進一步研究。

本研究僅從代謝抗性和抗氧化酶系活性方面研究了抗性產生的機理,但抗性的產生是否涉及編碼ACCase的基因的突變還有待于進一步研究。

[1] 李揚漢.中國雜草志[M]. 北京：中國農業出版社, 1998: 1222.

[2] Lee L J, Ngim J. A first report of glyphosate-resistant goosegrass (Eleusineindica(L.) Gaertn.) in Malaysia [J]. Pest Management Science, 2000, 56(4): 336-339.

[3] Heap I M, Knight R. The occurrence of herbicide cross resistance in a population of annual ryegrass,Loliumrigidum, resistant to diclofop-methyl [J]. Australian Journal of Agricultural Research, 1986, 37(2): 149-156.

[4] Heap I. International survey of herbicide resistant weeds[J/OL].(2015-03-09).http:∥www.weedscience.org/,2014.

[5] Leach G E, Devine M D, Kirkwood R C, et al. Target enzyme-based resistance to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitors inEleusineindica[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1995, 51(2): 129-136.

[6] Vidal R A, Portes E S, Lamego F P, et al. Resistência deEleusineindicaaos inibidores de ACCase [J]. Planta Daninha, 2006, 24(1): 163-171.

[7] Osuna M D, Goulart I, Vidal R A, et al. Resistance to ACCase inhibitors inEleusineindicafrom Brazil involves a target site mutation [J]. Planta Daninha, 2012, 30(3): 675-681.

[8] Mohamed I A, Li R, You Z, et al. Japanese foxtail (Alopecurusjaponicus) resistance to fenoxaprop and pinoxaden in China [J]. Weed Science, 2012, 60(2): 167-171.

[9] Tang W, Zhou F Y, Chen J, et al. Resistance to ACCase-inhibiting herbicides in an Asia minor bluegrass (Polypogonfugax) population in China [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2014, 108: 16-20.

[10]Li Lingxu, Bi Yaling, Liu Weitang, et al. Molecular basis for resistance to fenoxaprop-p-ethyl in American sloughgrass (BeckmanniasyzigachneSteud.) [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2013,105:118-121.

[11]李潔, 宗濤, 劉祥英, 等. 湖南省部分地區棉田牛筋草(Eleusineindica)對高效氟吡甲禾靈的抗藥性[J]. 棉花學報, 2014, 26(3): 279-282.

[12]蘇少泉. 除草劑在植物體內的代謝與選擇性及使用[J]. 現代農藥, 2003, 2(6): 14-17.

[13]Anderson M P, Gronwald J W. Atrazine resistance in a velvetleaf (Abutilontheophrasti) biotype due to enhanced glutathioneS-transferase activity [J]. Plant Physiology, 1991, 96(1): 104-109.

[14]Hall L M, Moss S R, Powles S B. Mechanisms of resistance to aryloxyphenoxypropionate herbicides in two resistant biotypes ofAlopecurusmyosuroides(blackgrass): herbicide metabolism as a cross-resistance mechanism [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1997, 57(2): 87-98.

[15]張朝賢, 倪漢文, 魏守輝, 等. 雜草抗藥性研究進展[J]. 中國農業科學, 2009, 42(4): 1274-1289.

[16]Powles S B, Yu Q. Evolution in action:plants resistant to herbicides [J].Annual Review of Plant Biology, 2010, 61: 317-347.

[17]Choudhary M, Jetley U K, Abash K M, et al. Effect of heavy metal stress on proline, malondialdehyde, and superoxide dismutase activity in the cyanobacteriumSpirulinaplatensis-S5 [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2007, 66 (2): 204-209.

[18]Pyon, J Y, Piao R Z, Roh S W, et al. Differential levels of antioxidants in paraquat-resistant and susceptibleErigeroncanadensisbiotypes in Korea [J]. Weed Biology and Management, 2004, 4: 75-80.

[19]Zabalza A, Gaston S, Sandalio L M, et al. Oxidative stress is not related to the mode of action of herbicides that inhibit acetolactate synthase [J]. Environmental and Experimental Botany, 2007, 59 (2): 150-159.

[20]吳進才, 許俊峰, 馮緒猛, 等. 稻田常用農藥對水稻3個品種生理生化的影響[J]. 中國農業科學, 2003, 36(5): 536-541.

[21]韓瑞娟.日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈抗性機理的研究[D].南京：南京農業大學,2010.

[22]Wang S H, Yang Z M, Yang H, et al. Copper-induced stress and antioxidative responses in roots ofBrassicajunceaL. [J]. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 2004, 45(3):203-212.

[23]Wang Yousheng, Yang Zhimin. Nitric oxide reduces aluminum toxicity by preventing oxidative stress in the roots ofCassiatoraL. [J]. Plant and Cell Physiology, 2005, 46(12): 1915-1923.

[24]Aebi H. Catalaseinvitro[J]. Methods in Enzymology, 1984, 105: 121-126.

[25]馬曉淵. 農田雜草抗藥性的發生為害, 原因與治理[J]. 雜草科學, 2002 (1): 5-9.

[26]Devine M D. Mechanisms of resistance to acetyl‐coenzyme A carboxylase inhibitors: a review [J]. Pesticide Science, 1997, 51(3): 259-264.

[27]Cummins I, Moss S, Cole D J, et al. Glutathione transferases in herbicide‐resistant and herbicide‐susceptible black‐grass (Alopecurusmyosuroides) [J]. Pesticide Science, 1997, 51(3): 244-250.

[28]Tal A, Romano M L, Stephenson G R, et al. Glutathione conjugation: a detoxification pathway for fenoxaprop-ethyl in barley, crabgrass, oat, and wheat [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1993, 46(3): 190-199.

[29]許長成, 樊繼蓮. 水稻對百草枯 (Paraquat)和一些環境脅迫交叉抗性[J]. 作物學報, 1996, 22(3): 358-361.

[30]吳進才, 劉井蘭, 沈迎春, 等. 農藥對不同水稻品種SOD活性的影響[J]. 中國農業科學, 2002, 35(4): 451-456.

[31]Choudhary M, Jetley U K, Abash K M, et al. Effect of heavy metal stress on proline, malondialdehyde, and superoxide dismutase activity in the cyanobacteriumSpirulinaplatensis-S5 [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2007, 66 (2): 204-209.

Resistance of Eleusine indica to quizalofop-P-ethyl in some cotton fields in Hunan Province

Zong Tao1, Li Jie1, Liu Xiangying1, Bai Lianyang2

(1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2.Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China)

In order to evaluate the resistance ofEleusineindicapopulations to quizalofop-P-ethyl, whole-plant bioassay was carried out and the differences in GSTs, SOD, POD and CAT of the resistant (R) and susceptible (S) populations to quizalofop-P-ethyl were preliminarily compared. The results of whole-plant bioassay showed that the populations ofE.indicahad different levels of resistance to quizalofop-P-ethyl, and the highest resistance index (RI) was 9.7, which was found in Xiangyin County. The activity of R population increased immediately, with a peak value of 2.6 times of the control, while the S population increased at first and then declined, with a peak value of 2.2 times. The SOD and POD activities of R population were significantly lower than that of S population in the medium term. The CAT activity of R population was significantly higher than that of S population after 9 days. The results indicated that the increased metabolic activity may be one of the resistance mechanisms to quizalofop-P-ethyl inE.indica. Oxidative stress may be related to the mode of action of quizalofop-P-ethyl.

Eleusineindica; quizalofop-P-ethyl; resistance

2014-01-06

2014-04-22

公益性行業(農業)科研專項(201303031)；湖南省自然科學基金項目(14JJ3096)

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.010

* 通信作者 E-mail:bailianyang2005@aliyun.com