小麥紋枯病菌中的dsRNA及其與菌株生物學特性的相關性

張 濤，杜文珍，張春燕，陳 瑩，于漢壽，李 偉*，陳懷谷*

(1. 江蘇省農業科學院植物保護研究所， 南京 210014；2. 南京農業大學生命科學學院， 南京 210095)

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小麥紋枯病菌中的dsRNA及其與菌株生物學特性的相關性

張 濤1,2，杜文珍1,2，張春燕1,2，陳 瑩1，于漢壽2，李 偉1*，陳懷谷1*

(1. 江蘇省農業科學院植物保護研究所， 南京 210014；2. 南京農業大學生命科學學院， 南京 210095)

對采集自我國山東、河南、江蘇、安徽4省的21株小麥紋枯病菌菌絲中的dsRNA進行了檢測，研究了dsRNA條帶與菌株菌落形態、生長速度、對小麥的致病力等生物學特性之間的相關性。結果表明，從16個菌株中檢測到dsRNA條帶，dsRNA的大小和數量存在豐富的多樣性。致病力測定結果表明這21個小麥紋枯病菌菌株的致病力差異顯著。目前暫未發現小麥紋枯病菌中dsRNA的類型和數量與菌株的菌落形態、生長速度及致病力等性狀存在明顯的相關性，但是致病力較弱的菌株中dsRNA條帶的多樣性更豐富。本研究為今后發掘小麥紋枯病菌中的低毒真菌病毒作了初步的探索。

禾谷絲核菌； dsRNA； 多樣性； 致病力

小麥紋枯病菌即禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealisvan der Hoeven)屬于雙核絲核菌的AG-DI融合群，能夠引起小麥紋枯病(sharp eyespot)及一些牧草的黃斑病(yellow patch)[1-3]。近些年來，由于全球環境變化、易感小麥品種廣泛種植，小麥紋枯病已在歐洲、北美、非洲、亞洲等地大面積傳播，引起產量損失及品質降低，嚴重危害小麥生產[4]。然而目前生產上缺少抗紋枯病的小麥品種，改變耕作措施等方法雖然可減輕病害的危害，但往往難以實現。化學防治是目前主要的防治方法，但防效不夠理想及潛在的病原菌抗藥性風險等是紋枯病化學防治面臨的最主要問題，因此有必要開發新的防治措施。

真菌病毒(mycovirus)是一類在真菌細胞中存在并復制的病毒，自Holling等首次對真菌病毒報道以來，已發現各類絲狀真菌及卵菌中普遍含有病毒[6-8]。目前發現的大多數真菌病毒的基因組為雙鏈RNA(dsRNA)，另有少數的為單鏈RNA(ssRNA)，極少數的為DNA[7-10]。真菌病毒通常不引起寄主真菌明顯的表型改變，但也有一些對其寄主能夠產生抑制作用，尤其是引起病原真菌致病力的衰退，而這些真菌病毒在植物真菌病害的生物防治中具有一定的應用潛力[7, 9-11]。利用板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)中的低毒病毒(Hypovirus)控制板栗疫病的危害在歐洲已經獲得了成功，而且低毒病毒與板栗疫病菌互作系統已經成為真菌病毒與寄主互作研究的模式系統[11-12]。近年來，從核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)中發現了一系列的致病力衰退相關病毒，其中有些種類具有很好的生防效果[9-10, 13-14]。

早在1978年，就有研究者報道在多核的立枯絲核菌(R.solani)一些菌株中存在的dsRNA可以減弱菌株致病力，通過其轉移有可能控制田間強毒力菌株[15]。1997年Jian等人從侵染馬鈴薯的立枯絲核菌AG-3融合群菌株中分離到一種3.57 kb的dsRNA病毒M2，能夠導致寄主真菌的致病力減弱[16]。M2編碼一段754個氨基酸的多肽A(polypeptide A)，能夠抑制真菌的莽草酸途徑(shikimate pathway)，從而影響真菌對碳源的利用，減弱寄主真菌的致病力[17]。在多核絲核菌的13個融合群中，全部能檢測到dsRNA病毒的存在，雖然有些病毒暫時不能確定是否會對寄主產生影響，但為從中發掘有生防潛力的真菌病毒提供了很好的資源[18-21]。但是，關于雙核絲核菌中的真菌病毒的研究很少，尤其是在引起小麥紋枯病的禾谷絲核菌中所含dsRNA的情況還很少有研究報道。

本研究對本實驗室2009和2010年在江蘇、安徽、山東、河南采集并保存的小麥紋枯病菌菌株進行了致病力測定，從中選取致病力強弱不等的21個菌株進行dsRNA的提取檢測，以揭示禾谷絲核菌中dsRNA的多樣性情況，并研究其與菌株生物學特性之間的關系，期望發現弱毒相關dsRNA病毒，從而為今后小麥紋枯病的生物防治提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本實驗室2009和2010年在山東、河南、江蘇、安徽麥田采集、分離的小麥紋枯病菌菌株，并已經過了形態學及分子生物學鑒定。根據致病力強弱選取了21株，分別為：R0904、R1041(江蘇盱眙)，R0928(河南南陽)，R0940、R0942、R0945(安徽蚌埠)，R0956、R0959(安徽界首)，R09104、R09111(河南信陽)，R1002、R1011(江蘇姜堰)，R0968、R1020、R1030(河南商丘)，R1053(江蘇高郵)，R1056(江蘇淮安)，R1084(山東菏澤)，R1095(山東曲阜)，R1090、R10125(山東濟寧)。

1.2 菌株的形態學觀察及生長速率測定

將菌株活化后，用打孔器打菌碟(d=5 mm)，以菌絲面向下轉接到PDA平板中央，25 ℃恒溫倒置培養8 d，每隔24 h觀察各菌株的菌落形態并測量菌落直徑，每個菌株3次重復。

1.3 菌株致病力的測定

取清水浸泡2 d后的小麥籽粒，置于三角瓶中高壓滅菌(120 ℃，1 h)，接入活化后的紋枯病菌菌株，25 ℃靜置培養20 d，每隔2 d振搖三角瓶以打碎結塊的麥粒。

將小麥品種‘揚麥158’種子播種于裝有1 kg無菌土外口徑為16 cm的塑料缽中，每缽播25粒，正常栽培管理，待小麥長到三葉期在小麥莖基部接入一粒病麥粒，每個菌株3個重復，接種4周后調查病情。病情調查參照Lipps等人的分級標準并細化為9個等級[2]，根據調查結果計算病情指數，使用DPS 7.05軟件對病情指數進行統計分析。

9級法調查紋枯病標準。

0級：無癥狀；

1級：外層葉鞘變褐或有明顯的紋枯病斑，但病斑≤1/2直徑；

3級：外層葉鞘有明顯的紋枯病斑，病斑>1/2直徑，但內層葉鞘無癥狀；

5級：內層葉鞘變褐或有明顯的紋枯病斑，但病斑≤1/2直徑；

7級：內層葉鞘有明顯的紋枯病斑，病斑>1/2直徑，但植株不死苗；

9級：植株死苗。

根據下列公式計算紋枯病病情指數：

1.4 dsRNA的提取和檢測

將活化的菌株接種在鋪有玻璃紙的PDA平板上，25 ℃培養10 d后，刮取表面菌絲，存放-70 ℃冰箱備用。dsRNA的提取方法參照Robinson和Deacon，并略加改動[21]。具體如下：取大約0.3 g菌絲在研缽中加液氮研成粉末轉移到2 mL離心管中，加入650 μL CTAB提取液(2%CTAB：100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；1%β-巰基乙醇。用前加3.5 μL蛋白酶K使終濃度為100 μg/mL)，混勻，置于65 ℃水浴20 min；每管加入650 μL苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，室溫振蕩10 min，7 500 r/min離心10～15 min；吸取上清液至新的2 mL離心管中，重復上述操作2次，最后一次采用氯仿抽提；取上清液至新的2 mL離心管中，加入用清洗緩沖液(0.05 mol/L Tris, 0.1 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.0)預平衡好的纖維素粉0.13 g和適量無水乙醇(至終濃度為16%)，振蕩混勻后冰浴30 min；將纖維素粉溶液振蕩混勻后倒入2 mL離心柱中，2 500 r/min離心1 min，棄濾液；加700 μL含16%乙醇的清洗緩沖液，2 500 r/min離心1 min，重復清洗5次；棄濾液，加入400 μL 65 ℃預熱的1×STE(0.05 mol/L Tris, 0.1 mol/L NaCI, 1 mmol/L EDTA,乙醇16%，pH 7.0)，靜置2 min，然后2 500 r/min離心1 min洗脫dsRNA；將收集到的洗脫液轉入1.5 mL離心管中，加1/10體積的3 moL/L NaAc(pH 5.2)和2倍體積無水乙醇，-20 ℃沉淀30 min；4 ℃，12 000 r/min離心20 min，棄上清，用100 μL預冷75%乙醇洗滌沉淀2次；放入超凈臺中風干，加入50 μL dd H2O溶解沉淀，-70 ℃保存備用。

提取到的dsRNA采用DNase I和S1核酸酶(TaKaRa)按照說明書酶解去除其中的DNA和ssRNA。采用含有EB的1%瓊脂糖凝膠，上樣30 μL在0.5×TBE緩沖液中恒壓120 V，電泳1.5 h，在紫外燈下觀察電泳結果。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態學觀察與生長速率的測定

21個供試菌株平均生長速率為(1±0.25)cm/d。不同菌株的培養性狀有一定差異，其中R1002具有旺盛的氣生菌絲，產菌核較多；R1041生長很快，5 d即可鋪滿平皿，氣生菌絲向空間蔓延，但菌絲稀疏細弱；R0959生長較快，菌絲緊貼培養基表面，氣生菌絲很少，少數菌株如R10125、R1053、R0928生長較慢，幾乎不產菌核(圖1)。而R10125在生長一段時間后，從菌落中心向外的菌絲逐漸致密硬化，氣生菌絲很少，幾乎不產菌核。不同菌株間的生長速率差異不顯著(圖2)。

圖1 禾谷絲核菌部分菌株菌落形態(PDA培養基, 25 ℃, 12 d)Fig.1 Colony morphology of the R.cerealis isolates cultured on PDA (25 ℃, 12 d)

圖2 供試禾谷絲核菌菌株的菌絲生長速率Fig.2 The mycelial growth rate of different R.cerealis isolates

2.2 菌株致病力的測定

21個禾谷絲核菌菌株的致病力如圖3所示。不同菌株間致病力差異顯著，其中致病力最強的菌株為R1011，病情指數為66.7；致病力最弱的菌株為R1002，病情指數僅為9.6。菌株致病力的強弱沒有地域相關性。

2.3 小麥紋枯病菌菌絲中的dsRNA檢測

為檢驗dsRNA的提取效果，首先用菌株R0959和R10125做了預試驗。在1%瓊脂糖凝膠上的電泳檢測結果如圖4，粗提取物中除在15 kb左右有一條明顯的條帶外，在2.5 kb以下的位置有很多彌散的核酸。采用DNase I處理后，這些彌散的核酸仍然存在。再經S1核酸酶處理后這些彌散的條帶消失，而且菌株R10125從6.5 kb往下顯露出4條明顯的條帶。結果說明經雙酶解之后仍然存在的核酸為dsRNA，而粗提取物中的彌散條帶多數是單鏈的RNA。

圖3 供試禾谷絲核菌菌株致病力Fig.3 Virulence comparison between different R.cerealis isolates

圖4 R0959和R10125中dsRNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of dsRNA from R0959 and R10125

從21個菌株中提取并經過DNase I和S1核酸酶雙酶解純化的dsRNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明除R1002、R0940、R0968、R09111、R1011看不到明顯條帶外，其余16個菌株都含有dsRNA，各菌株所含dsRNA條帶數量及大小存在明顯差異。并且這16株菌都包含一條大于15 kb的dsRNA條帶；R1041在10 kb左右有一條帶；R1084、R10125、R1095在6.5 kb處有一明顯條帶；R0928、R1084、R10125在3～1.5 kb之間有3個條帶；R0942在2～1.5 kb之間也有清晰的2個條帶；此外R09104、R1056在2 kb區域也有dsRNA條帶。檢測到dsRNA的這些菌株中，最少只有大于15 kb的這一條帶，最多如R1084、R10125中可以清楚看到5條帶(圖5)。

3 討 論

禾谷絲核菌大多數菌絲為白色，比較粗壯，均勻向外生長，菌絲與培養基貼合緊密，氣生菌絲旺盛或較少。不同菌株在菌落形態、菌核產量、色素等培養性狀上存在一定差異，某些菌株生長異常。通過菌株的形態、生長速率及致病力測定結果之間的比較，雖然21株禾谷絲核菌菌落形態、生長速率等方面差異不大，但其致病力存在明顯差異，致病力分化與地理來源沒有明顯的關系。形態異常的菌株如R1004、R10125其致病力很弱，并且產色素較多，菌絲呈褐色，產菌核量很少；弱致病力菌株R10125在培養中觀察到其生長的某些時期會發生退化，從中心向外菌絲逐漸變得致密，呈花環狀，同時生長變緩，顏色加深，氣生菌絲很少；通常寄主真菌被弱毒病毒侵染后，其菌落形態常常會發生異常，如菌絲分支增多，生長緩慢，產菌核量減少，致病力較弱等現象[22-24]。但R10125的這些性狀是否是由dsRNA引起的還有待進一步研究。

圖5 從禾谷絲核菌不同菌株中提取的dsRNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of dsRNA isolated from different isolates of R.cerealis

真菌中病毒的基因組多是dsRNA和ssRNA，極少數是DNA[7-9, 11]，無論是dsRNA還是ssRNA病毒，其在復制過程中都會形成dsRNA[25]。dsRNA具有比ssRNA更好的穩定性和可操作性，為我們研究真菌病毒提供了方便。1979年Morris和Dodds成功開發了一種植物或真菌組織中dsRNA的提取方法：將植物或真菌組織破壁，加入去污劑等使蛋白變性，用苯酚氯仿去除蛋白，關鍵一步是在15%～17%濃度的乙醇中dsRNA能夠與纖維素粉結合，通過洗脫除去DNA及單鏈RNA，從而獲得純化的dsRNA[26]。雖然也有研究者采用LiCl等方法提取dsRNA，但遠沒有纖維素粉方法簡便高效[27-28]。本研究采用該方法提取了禾谷絲核菌中的dsRNA，采用兩種核酸酶進行了酶解，其中DNase I能夠特異性降解單鏈或雙鏈的DNA，S1核酸酶能夠降解單鏈的DNA或者RNA，也可以降解雙鏈核酸中的單鏈部分。最終的電泳結果表明我們從禾谷絲核菌中提取到了質量較高的dsRNA(圖4～5)。

對21株禾谷絲核菌dsRNA的檢測發現，16株dsRNA陽性與5株dsRNA陰性菌株中既有弱致病力菌株，也有強致病力菌株，并且各菌株所含dsRNA的大小與數量具有一定的多樣性。所有16株dsRNA陽性的菌株雖然致病力不同但都含有一條大于15 kb的dsRNA，此外3個弱致病力菌株R0928、R1084、R10125譜帶中都額外含有2.5 kb、2 kb和1.8 kb 3個條帶，但致病力中等的R0942也含有同樣大小的條帶；而弱致病力菌株R1084和R10125還含有一條6.5 kb的dsRNA條帶，說明同一菌株中可能含有多種dsRNA病毒。暫時未發現菌株所含dsRNA條帶數目與菌株致病力之間的關系，但是致病力較弱的菌株如R10125、R1084、R0928中dsRNA條帶的多樣性更加豐富(圖5)。自然情況下，禾谷絲核菌很少發生有性世代，一般也不產生無性孢子，其中所含病毒無法進行垂直傳播，理論上只能通過菌絲融合進行水平傳播，而田間復雜的自然環境又可能會影響其水平傳播的效率，因此不同菌株中所含病毒種類可能會形成豐富的多樣性。真菌病毒絕大多數對寄主不產生任何影響，只有少數能減弱寄主的致病力，同一病原真菌中含有多種病毒的情況也比較常見[27]。比如在核盤菌菌株Ep-1PN中存在大小為6.0 kb、5.4 kb和853 bp的3種dsRNA片段：6.0 kb的條帶是核盤菌RNA病毒(SsRV-L)，5.4 kb的條帶是核盤菌致病力衰退相關的ss(+)RNA病毒(SsDRV)，853 bp的條帶可能為SsDRV的缺損形式[13-14,23]。其中只有5.4 kb片段病毒能夠引起宿主真菌的致病力減弱[13,23]。

小麥紋枯病菌中的dsRNA具有豐富的多樣性，在進一步的研究中需要對這些條帶的核酸序列進行分析，明確其對寄主真菌的生物學特性尤其是致病力的影響，從而為發掘具有生防潛力的弱毒相關真菌病毒提供具有價值的參考。

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The double-stranded RNAs and their association with the biological characteristics ofRhizoctoniacerealis

Zhang Tao1,2, Du Wenzhen1,2, Zhang Chunyan1,2, Chen Ying1,Yu Hanshou2, Li Wei1, Chen Huaigu1

(1. Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;2. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, twenty-one strains ofRhizoctoniacerealis, the causal agent of sharp eyespot of wheat, from Shandong, Henan, Jiangsu and Anhui Provinces were selected to detect the dsRNA elements. The results showed that the dsRNAs were detected from 16 strains, and the size and quantity of dsRNAs in these strains were diverse. It indicated that the dsRNAs were common amongR.cerealisstrains. The virulence of these strains on wheat seedlings was tested and it was significantly different among strains. No obvious effects of dsRNAs on the colony morphology, growth rate and pathogenicity of these strains were found in this study. However, the diversity of dsRNAs was richer in less virulent strains than that in the other strains. This study gives a preliminary exploration for finding new potential biocontrol mycoviruses.

Rhizoctoniacerealis; dsRNA; diversity; pathogenicity

2014-03-03

2014-06-05

江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX(11)4015]；國家自然科學基金(30900928)；小麥產業技術體系建設項目(CARS-3-1-17)

S 435.121.49

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.015

* 通信作者 E-mail: lw0501@jaas.ac.cn； huaigu@hotmail.com