一種新油茶炭疽病原多基因序列鑒定

李 河，周國英，徐建平

(經濟林培育與保護教育部重點實驗室，中南林業科技大學林學院，長沙 410004)

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一種新油茶炭疽病原多基因序列鑒定

李 河，周國英*，徐建平

(經濟林培育與保護教育部重點實驗室，中南林業科技大學林學院，長沙 410004)

從湖南、廣西油茶葉上分離獲得5株能侵染油茶樹的病原菌。通過柯赫氏法則證明該病原菌為油茶炭疽病的致病菌。病菌菌落圓形，初期為白色，逐漸變為淺灰色；氣生菌絲由白色和灰白色漸變為深灰色絨狀；菌落背面中心顏色深，外部顏色淺；菌絲劃傷后在PDA 培養基上能產生橘黃色的分生孢子堆，分生孢子為單胞、直、圓柱狀、無色、光滑、兩頭鈍圓或一端稍尖，分生孢子大小(11～15)μm×(4～5)μm；菌絲體附著胞不規則狀，淺褐色，(8～12)μm×(5.5～7)μm。采用形態學結合多基因(核糖體內轉錄間隔區(ITS)、鈣調蛋白-CAL、3-磷酸甘油醛脫氫酶-GAPDH)系統學的方法對它們進行鑒定，結果發現，5個菌株均為暹羅刺盤孢(Colletotrichumsiamense)。這是國內油茶上C.siamense的首次報道。

油茶；Colletotrichumsiamense; 炭疽病; 病原菌; 多基因序列

油茶(Camelliaoleifera)是原產于我國的食用木本油料樹種。茶油中不飽和脂肪酸含量高，可降低血脂、肝脂，防止血栓形成，對冠心病和動脈粥樣硬化有良好的預防作用[1]。近幾年，隨著我國大力發展油茶產業，各油茶產區的炭疽病發生越來越嚴重，造成重大經濟損失[2]。目前，國內學者認為油茶炭疽病是由膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)引起[3-7]。本研究通過病原菌分離、致病性測定，并結合形態特征和多基因分子鑒定，發現炭疽屬的暹羅刺盤孢(ColletotrichumsiamensePrihastuti,L.Cai & K.D.Hyde)也能引起油茶炭疽病。這是首次在油茶上發現這種病原菌，研究結果可對該病害的防治及抗病育種工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與培養

油茶病葉采自湖南省和廣西壯族自治區。采用常規分離法，從病葉病健交界處組織進行分離，純培養物斜面培養后4 ℃冰箱保存備用。

1.2 病原菌形態學觀察

觀察菌落特征，光學顯微鏡下觀察菌絲及分生孢子形態特征，并測量其大小。

1.3 回接試驗

采用國家審定品種‘長林55號’油茶活體植株葉，用75%乙醇表面消毒處理，細針蘸取分離菌株的孢子懸浮液后刺扎油茶葉，以滅菌水處理為對照(CK)，離體條件下觀察病害發生發展情況，并對接種后發病葉進行病菌再分離。

1.4 病菌多基因的PCR 擴增與序列分析

1.4.1 病原菌DNA 的提取

病原菌DNA 的提取參考夏花等[8]的試驗方法。將分離菌株接種到PDA平板上進行活化，于28 ℃培養箱中黑暗培養6 d后，用滅菌的藥匙將菌絲刮下，稱取0.5 g于研缽中，加入1 mL 裂解液，3/10 體積石英砂，研磨充分后轉入1.5 mL EP管中，65 ℃水浴10 min，然后加入600 μL 7.5 mol/L NaCl溶液，冰浴 8 min后13 000 r/min 離心5 min; 取600 μL上清液到一個新的EP管中，加400 μL 氯仿：異戊醇(24∶1)，混勻; 靜置分層后取500 μL 上清液至另一新EP管，加入0.1倍體積NaAc和2倍體積的無水乙醇，14 000 g離心8 min 后收集DNA，用70%乙醇洗DNA 2 次; 待乙醇揮發后，用0.1×TE溶解DNA，-20 ℃保存。

1.4.2 基因選擇及目的片段擴增與測序

參照陳國慶[9]、楊友聯[10]的研究結果，對所有分離篩選獲得的菌株，選擇核糖體轉錄間隔區(ITS)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)和鈣調蛋白基因(CAL)進行擴增與測序。相應的PCR擴增引物見表1。反應體系及條件參見陳國慶[9]。PCR 產物委托上海鉑尚生物技術有限公司測序。

表1 試驗所用引物和退火溫度

1.4.3 菌株ITS基因系統發育樹構建

將本試驗分離的5個菌株ITS 序列與GenBank數據庫中炭疽菌ITS序列進行比對，采用MEGA軟件鄰近法(neighbor-joining N-J)，構建系統發育樹，以自展法(bootstrap)進行檢測，1 000 次循環。

1.4.4 菌株多基因系統發育樹構建

將測序獲得的每個菌株的3個基因，經過Clustal W軟件比對且手工校正后的各個基因按照ITS-CAL-GAPDH的順序分別首尾相連，并下載GenBank中同時含有ITS、CAL和GAPDH 3個基因序列的炭疽屬菌株及模式菌株序列，也按照ITS-CAL-GAPDH的順序首尾相連后進行同源性分析，用軟件MEGA 4.0構建所有菌株3個基因組合的N-J系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測定

從湖南、廣西兩省油茶產區分離、純化獲得形態特征疑似炭疽病的病原菌5株，回接試驗表明，這5株真菌能引起一致的癥狀(圖1)：病葉初期呈褐色斑點，然后逐漸變成黑褐色病斑。對回接后發病的病斑組織再次進行病原菌分離，獲得與原接種菌株形態特征一致的菌落和分生孢子；無菌水(CK)處理未發現病斑，也未分離到病菌。由此可確定，這5株菌是引起油茶炭疽病的病原菌，它們的地理分布見表2。

圖1 油茶樹葉片炭疽病病斑

樣品采集地及數量Sitesandsamplesize菌株編號Strainno．GenBank登錄號GenBankaccessionno．ITSCALGAPDHHNTJL8KJ131601KJ132198KJ131800湖南3株HNTJL10KJ131602KJ132199KJ131801HNTJL20KJ131603KJ132200KJ131802廣西2株GXNN3KJ131595KJ132192KJ131794GXNN5KJ131596KJ132193KJ131795

2.2 病菌形態特征

病菌形態特征見圖2(只顯示GXNN3菌株，其他菌株形態特征相同)。5個菌株在PDA培養基上，28 ℃培養10 d后，菌絲呈等徑輻射生長，呈地毯狀平鋪，菌落圓形，初期為白色，逐漸變為淺灰色；氣生菌絲由白色和灰白色，漸變為深灰色絨狀；菌落背面中心顏色深，外部顏色淺；菌絲劃傷后在PDA 培養基上能產生橘黃色的分生孢子堆，分生孢子為單胞，直、圓柱狀、無色、光滑、兩端鈍圓或一端鈍圓，另一端稍尖，分生孢子大小：(11～15)μm×(4～5)μm(n=50)；菌絲體附著胞淺褐色至深褐色，邊緣不規則，有時形成多級次生附著胞，呈鏈狀，(8～12)μm×(5.5～7)μm(n=30)。在PDA平板培養過程中未觀察到有性態。

圖2 炭疽菌菌株的形態特征Fig.2 Morphology of the pathogen causing the anthracnose

2.3 菌株rDNA-ITS基因系統發育分析

5個菌株的18S rDNA-ITS基因系統發育結果(圖3)顯示，5個菌株聚為Ⅰ和Ⅱ 2個分支，分支Ⅰ包括分離自廣西南寧2個菌株GXNN3、GXNN5和C.tropicale、C.queenslandicum、C.clidemiae、C.ti等4個種，分支Ⅱ包括湖南分離的3個菌株(HNTJL8、HNTJL10、HNTJL20)和C.siamense的1個分離物，另外我們還發現C.siamense的另外2個分離物與炭疽屬其他種聚在分支Ⅲ，且系統樹各分支處大部分自展值都非常低，由此可以看出，ITS基因無法準確區分炭疽屬所有種。

2.4 菌株多基因系統發育分析

5個菌株的編號及每個基因的GenBank 登錄號見表2，5個菌株的ITS-CAL-GAPDH序列與GenBank下載的菌株序列的聚類分析結果(圖4)顯示，5個分離菌株與所有參與分析的4株C.siamense聚為一支(其中ICMP 18642、ICMP19118為模式菌株)，自展支持率為87%，能夠與炭疽屬其他種區分開，再結合各菌株的形態學特征可以確定所分離到的病原菌為C.siamense。這說明，ITS、CAL和GAPDH 3個基因序列拼接起來后構建的N-J系統發育樹能準確區分和鑒定炭疽菌的近緣種。

圖3 依據ITS序列用N-J方法構建的Colletotrichum spp.系統發育樹Fig.3 The N-J phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequences of Colletotrichum spp.

圖4 依據ITS-CAL-GAPDH 3基因合并序列用N-J法構建Colletotrichum spp.系統發育樹Fig.4 The N-J phylogenetic tree based on the ITS-CAL-GAPDH sequences of Colletotrichum spp.

3 討論

炭疽菌中許多種的分生孢子、附著胞都較相似，對于非專業分類研究者來說，單從分生孢子和附著胞等形態學特征，較難進行炭疽菌種的鑒定。此外，一些學者認為，僅根據形態學特征來進行炭疽菌種的鑒定與分類通常是不適當的[15-16]。隨著分子生物學手段的運用，基于分子標記的系統學方法被引入該屬真菌的分類[10-11]。ITS 序列在炭疽菌屬系統學中的運用，為部分物種的鑒定及系統進化分析提供了有力的工具。例如,C.boninense基于形態特征，最初被鑒定為C.gloeosporioides, 隨后, 利用ITS 序列進行系統分析，獨立為新的分類單元[17]。但由于ITS 在該屬系統學研究中的局限性，如對多數近緣種，構建的系統樹在一些關鍵進化節點的支持率較低，不能有效進行識別[18]。Avise和Wollenberg 曾指出利用ITS序列不能有效地用于種的識別，可能會導致錯誤的結論[19]。本研究中，我們分離的5株病菌的ITS序列與GenBank中的Colletotrichum屬其他種的ITS序列構建系統發育樹，這5株菌株與該屬其他5個種聚為2支，且各分支處大部分自展值都非常低，系統發育樹無法區分它們，表明基于ITS 序列不能進行該屬的所有物種識別。

Taylor 等[21]主張基于多基因譜系識別生物學種，并提出了系統學種(phylogenetic species)的概念，以區別于過去的形態學種和生物學種。伴隨著多基因分析方法的引入，提高了炭疽菌屬真菌鑒定的準確率[9-14, 22-23]。Crouch 等[24]運用ITS、Apn2、Mat1/ Apn1 和Sod2 基因進行聯合分析，把形態上極難區分識別的復合種C.graminicola區分開來，恢復C.cereale和C.eleusines為合格種，并引入了6個新種，同時該研究發現，其聚類與寄主有關，分別對應C3 和C4 植物。Weir 等采用形態學和多基因譜系方法將膠孢炭疽菌復合種分成了22 個種和1 個亞種[11]。

本研究的病原菌株C.siamense是從我國2個不同省份油茶樹上分離獲得的，它們的形態特征與楊友聯[10]、Weir[11]、韓永超[12]和Prihastuti[13]描述的C.siamense的形態特征吻合。多基因序列構建N-J系統發育樹，5個分離菌株與所有C.siamense聚為一支(其中ICMP 18642、ICMP19118為C.siamense模式菌株)，其他分支中，相同種菌株也都以非常高的支持率聚在一起。這表明，ITS、CAL和GAPDH三個基因聯合起來能準確區分和鑒定炭疽菌的近緣種。據報道C.siamense首次在泰國咖啡上被發現，并且可以寄生多種熱帶和亞熱帶植物[13]。在我國的云南省也發現該菌，其寄主包括草莓和竹葉蘭等[10,12]。我們首次發現C.siamense能侵染油茶樹。從供試樣本來看，C.siamense采自湖南和廣西兩省(自治區)，其地理分布較廣，說明該病菌對環境變化的潛在適應能力強，容易擴展其分布范圍。目前，對C.siamense的研究僅限于種名的鑒定，而其生物學、生態學、流行病學、種群遺傳結構和有效的防治措施未見報道，應該進一步對該菌深入研究，這對控制該病菌引起的油茶炭疽病具有重要意義。

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Pathogen identification of a new anthracnose of Camellia oleifera in China based on multiple-gene sequences

Li He, Zhou Guoying, Xu Jianping

(The Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education, College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

Five strains of anthracnose pathogen ofCamelliaoleiferawere isolated from two provinces of China. The pathogenicity tests were performed using conidial suspension ofColletotrichumsp. on young and healthy leaves ofC.oleifera, and theColletotrichumsp. isolates were confirmed as the pathogenic fungi. Isolations were transferred onto PDA plates and showed circular colonies. These morphological characteristics of colonies were first white and then turned grey and grey black. The pile of spores was jacinth. Conidia were oblong, single-celled, colorless, (11-15)μm×(4-5)μm in size. Mycelial appressorium was clava-like, brown, smooth-edged and intact, (8-12)μm×(5.5-7)μm in size. We identified these isolates based on morphological characters and phylogenetic analysis of multilocus (ITS, CAL, GAPDH) sequences. The results showed that the pathogen causing anthracnose ofC.oleiferawasC.siamense. This is the first report ofC.siamenseonC.oleiferain China.

Camelliaoleifera;Colletotrichumsiamense; anthracnose; pathogen; multiple-gene sequences

2014-03-21

2014-06-17

國家自然科學基金(31100479)

S 435.659

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.016

* 通信作者 E-mail：zhouguoying77@163.com