反枝莧對咪唑乙煙酸抗性水平及分子機制

陳金奕，張朝賢*，黃紅娟，魏守輝，劉 延，黃兆峰，陳景超，楊 龍，王 旭

(1.中國農業科學院植物保護研究所，中國農業科學院雜草鼠害生物學與治理重點開放實驗室，北京 100193；2.黑龍江農墾科學院，哈爾濱 150038)

?

研究簡報
Research Notes

反枝莧對咪唑乙煙酸抗性水平及分子機制

陳金奕1，張朝賢1*，黃紅娟1，魏守輝1，劉 延2，黃兆峰1，陳景超1，楊 龍1，王 旭1

(1.中國農業科學院植物保護研究所，中國農業科學院雜草鼠害生物學與治理重點開放實驗室，北京 100193；2.黑龍江農墾科學院，哈爾濱 150038)

為初步明確大豆田反枝莧對咪唑乙煙酸的抗藥性水平，并從分子角度對抗藥性機制進行解釋，以我國四川成都和黑龍江嫩江采集的反枝莧種子為材料，通過瓊脂法檢測了反枝莧對咪唑乙煙酸的抗藥性水平，并分別對R(嫩江抗性種群)和S(成都敏感種群)的乙酰乳酸合成酶(ALS)部分序列進行擴增和測序。皿內生測結果表明，成都種群的GI50為11.20，嫩江種群的GI50為52.26，其抗藥性指數RI為4.67。分子檢測結果表明，與S種群相比，R種群反枝莧ALS位于高度保守區Domain B編碼574位氨基酸的基因發生突變，TGG突變為TTG，導致色氨酸被亮氨酸取代。ALS保守區域氨基酸的替換可能是嫩江反枝莧種群對咪唑乙煙酸產生抗性的重要原因之一。

反枝莧； 咪唑乙煙酸； 抗藥性； 突變

反枝莧(AmaranthusretroflexusL.),英文名為redroot pigweed，別名為西風谷、野米谷等，是我國農田、果園常見的一年生莧科闊葉雜草。反枝莧于19世紀40年代入侵我國，因產籽量大、適應性強的特點而廣泛分布，在我國暖溫帶危害面積達36%[1-3]，在世界多地被列為惡性雜草。咪唑乙煙酸，商品名為普施特，是20世紀80年代美國氰胺公司開發的咪唑啉酮類除草劑優秀品種, 作用靶標為乙酰乳酸合成酶(ALS)，目前廣泛應用于大豆田化學除草。針對其殘留特點，目前已成功開發了抗咪唑啉酮類作物如玉米、油菜、小麥、水稻等，擴大了該類除草劑的應用范圍[4]。乙酰乳酸合成酶，又名乙酰羥酸合成酶，是由細胞核編碼的葉綠體酶。它是控制植物體內合成支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)公共途徑的關鍵酶，為磺酰脲類、咪唑啉酮類等多種高效低毒除草劑的靶標酶。

世界范圍內已對ALS抑制劑抗藥性進行了很多報道。目前已發現的144種ALS抑制劑抗藥性雜草中，共有8個ALS基因位點突變的發生經證實與抗藥性產生直接相關[5-7]。這些位點在擬南芥ALS氨基酸序列中相應的位置及表達的氨基酸分別為第122 位丙氨酸(Ala122)，第197位脯氨酸(Pro197)，第205位丙氨酸(Ala205)，第376位天冬氨酸(Asp376)，第377位精氨酸(Arg377)，第574位色氨酸(Trp574)，第653位絲氨酸(Ser653)和第654位甘氨酸(Gly654)。高等植物ALS氨基酸序列有5個不連續的高度保守區，分別為Domain C、Domain A、Domain D、Domain B 和 Domain E。其中，A122位于Domain C；P197位于Domain A；A205位于Domain D；W574位于Domain B；S653位于Domain E。

國外最早于1980年分別在加拿大、法國、德國和美國的農田發現了抗莠去津的反枝莧。我國于1990年在黑龍江的多個地塊也發現了抗莠去津的反枝莧[8]，另外抗氯嘧磺隆的反枝莧也在遼寧省有發現[9]。但我國反枝莧抗藥性及其機理尚未明確。本研究旨在初步明確我國黑龍江大豆田反枝莧對咪唑乙煙酸的抗藥性水平，探索反枝莧的抗藥性分子機制，為農田雜草抗藥性的監測和治理提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草種：采自四川、黑龍江的2個反枝莧(A.retroflexus)種群(見表1)。

供試藥劑：50 g/L咪唑乙煙酸水劑(巴斯夫歐洲公司)。

表1 反枝莧種群采集地點及用藥史

1.2 抗藥性水平測定

1.2.1 瓊脂法

種子催芽: 反枝莧種子在200 mg/L的赤霉素溶液中浸泡12 h，打破休眠。浸泡后的種子洗凈晾干。在直徑為90 mm的培養皿中墊雙層濾紙，加入10 mL蒸餾水。播入待測反枝莧種子，加蓋后放入RXZ-280 c型人工氣候箱中培養，選取整齊露白的種子待測。催芽條件為光照14 h，黑暗10 h，溫度30 ℃，濕度33%。

根據預試驗結果，參照曹坳程[10]的方法，依次取10 mL不同濃度的咪唑乙煙酸藥液與20 mL溫度約65 ℃的瓊脂水溶液(質量分數為0.8%)混勻，使混合液中有效成分咪唑乙煙酸的終濃度分別達到7、14、28、56、112、224 mg/L，使用移液槍吸取10 mL混合液轉入3個培養皿(直徑60 mm)中。以蒸餾水為對照。待瓊脂冷卻后，各種群選擇整齊露白的反枝莧種子20粒，均勻播入皿內。加蓋，使用封口膜封閉。在光照14 h，黑暗10 h，光照強度為10 000 lx，溫度(27±1)℃，濕度(30±7)%的RXZ-280 c型的人工氣候箱中培養5 d后，測量各皿中20株反枝莧的根長、芽長并記錄。

1.2.2 數據統計

計算2種群的芽長抑制率，公式如下：

芽長抑制率(%)=(對照芽長-處理芽長)/對照芽長×100。

使用DPS v 7.05軟件，將芽長抑制率轉化為幾率值，求得毒力回歸方程、生長抑制中濃度(GI50)、相關系數r。并根據以下公式計算出抗藥性指數(RI)：

抗藥性指數(RI)=抗藥性種群GI50/敏感性種群GI50。

1.3 分子檢測

1.3.1 試材培養

取成都、嫩江2種群種子催芽(步驟同瓊脂法)后播種。取上口直徑10 cm，高10 cm的塑料盆，填入砂壤土與草炭體積比為2∶1的土壤，每盆均勻播種約30粒種子，覆土1 cm，置于溫室內培養。試驗期間溫室溫度白天(30±5)℃，夜間為(20±5)℃，相對濕度(60±5)%。在2～3葉期間苗，每盆定株10株。待葉片長至4～6葉期，各種群取至少10株單株的幼嫩葉片(0.3 g/株)，經消毒處理后，單株包裝，放入-80 ℃冰箱內保存，備用。

1.3.2 引物設計與合成

根據NCBI的GenBank于2005年提交的反枝莧ALS序列(登錄號AF363369.1)設計4對引物(表2)，分別包括已經報道并確認能夠產生抗性的8個突變位點。其中，IF/IR擴增包括Ala122在內的192 bp的片段；ⅡF/ⅡR擴增包括Pro197、Ala205兩個位點在內的385 bp的片段；ⅢF/ⅢR擴增片段為210 bp，包含Asp376、Arg377兩位點；IVF/IVR擴增片段為410 bp，包含Trp574、Ser653、Gly654三個位點。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。用溫度梯度PCR儀(Biometra T-Gradient Thermoblock)確定每對引物的最佳退火溫度。

表2 擴增反枝莧ALS基因的4對引物

1.3.3 ALS基因片段的克隆

兩種群單株植物葉片分別在液氮中研磨成細粉，使用Tiangen公司的DNAquick Plant System快捷型植物基因組DNA提取系統提取基因組DNA，兩種群各獲得10株植物的DNA樣品。PCR的25 μL反應體系包括：8.5 μL的ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix(Tiangen公司)，2 μL的反枝莧基因組DNA，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。PCR條件設定為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，X ℃退火30 s(X為4對引物的退火溫度)，72 ℃延伸30 s，共33個循環；最后72 ℃延伸10 min。

擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。對目的條帶進行切膠回收，純化后連接到pMD18-T載體，然后轉到大腸桿菌感受態細胞中，涂布于含有ampicillin和X-gal/IPTG的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜。挑取15個白色單菌落到含ampicillin的LB培養液中，以200 r/min的速度在37 ℃ 振蕩培養5 h，然后以菌液為模板進行轉化鑒定。25 μL的PCR體系包括：9.5 μL ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix(Tiangen公司)，1 μL的菌液，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。電泳檢測后，挑選至少5個陽性克隆送北京三博遠志生物技術有限責任公司進行測序驗證，引物為通用引物M13，單向測序。

1.3.4 生物信息學分析

用DNAMAN v6軟件對試驗反枝莧種群ALS基因片段的測序結果進行比對，尋找8個突變位點的差異性。

2 結果與分析

2.1 瓊脂法測定反枝莧對咪唑乙煙酸的抗藥性水平差異

圖1為瓊脂法中，按照有效成分咪唑乙煙酸濃度遞增順序排列的反枝莧幼苗形態。由圖可見，隨著藥劑濃度的增加，成都種群(a)在7 mg/L時根長即顯著受到抑制；嫩江種群(b)在7 mg/L根長幾乎沒有變化，當藥劑濃度增加到56 mg/L時，根長才明顯受到抑制。與抗藥性種群相比，敏感性種群的根長對除草劑的反應更加敏銳，這與Tal等[11]進行的試驗中，硬直黑麥草對禾草酸的種子生測反應結果一致。

圖1 反枝莧對咪唑乙煙酸的皿內生測反應Fig.1 Response of two Amaranthus retroflexus populations to imazethapyr in seed-bioassay

2個反枝莧種群對咪唑乙煙酸的抗藥性水平回歸分析結果見表3。從表3可看出，線性回歸相關系數r均大于0.90，說明隨著咪唑乙煙酸濃度的增加，反枝莧芽長逐漸縮短的變化規律符合線性回歸。成都種群的GI50為11.20 mg/L，嫩江種群的GI50為52.26 mg/L。抗藥性指數(RI，resistance index)為4.67。

表3 反枝莧對咪唑乙煙酸的抗性水平

2.2 反枝莧ALS基因片段的生物學信息分析

經基因組DNA提取、包含8個突變位點的部分ALS片段的PCR擴增、連接轉化及鑒定、測序等步驟，獲得目的片段的核苷酸序列。將各長度一致片段與擬南芥ALS序列進行比對后發現，與S種群相比，R種群的10株單株均在高度保守區Domain B處發生了基因突變。TGG突變為TTG，導致574位的色氨酸被亮氨酸取代。

表4 擬南芥與反枝莧R、S種群ALS基因片段及編碼氨基酸的比較1)

1)加粗字體為574位編碼氨基酸的核苷酸突變情況。

The bold nucleotide bases show the mutations in R populations compared with those inArabidopsis.

3 討論

本試驗通過瓊脂法，對采自四川和黑龍江省2個反枝莧種群的抗藥性水平進行了快速檢測，結果表明，與成都種群(S)相比，嫩江種群(R)的抗藥性指數RI為4.67，已經產生了一定程度的抗性。對咪唑乙煙酸靶標酶ALS部分片段進行克隆、測序后發現，抗藥性種群——黑龍江嫩江種群的靶標酶ALS的高度保守區域Domain B發生了基因突變，574位TGG突變為TTG，導致色氨酸被亮氨酸取代。突變的發生可能是導致反枝莧對咪唑乙煙酸產生抗藥的重要原因之一。

皿內種子測定法是常用的農田雜草抗藥性檢測方法，皿內介質通常有濾紙和瓊脂2種。2007年Yang等采用濾紙法研究日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈的抗性[12]，其結果與整株植物測定法趨勢一致。Tal等[11]在檢測幾種禾本科雜草對ACCase抑制劑類除草劑的抗藥性水平試驗中，使用了濾紙法。黃媛媛等[9]在檢測反枝莧對氯嘧磺隆的抗藥性水平時采用了瓊脂法。盡管相對于整株植物測定法和酶活測定等方法來說，皿內生測的結果不夠準確(具體表現在測定的抗性指數值較低)，但其具有試驗周期短、占用場地小、節省人力等優點，是快速鑒定抗性種群的方法之一。

雜草對ALS抑制劑的抗藥性機制主要有靶標位點抗性(TSR，target-site resistance)和非靶標位點抗性(NTSR，non-target-site resistance)2種。基于靶標位點的ALS抑制劑抗性是由于ALS的編碼基因中單個氨基酸的取代造成的[13-15]，這種取代在ALS基因內部許多位點均有發生。在過去20年里，在50個雜草種群中，共發現8個突變位點以及26種氨基酸替代方式。迄今為止，在28種抗性雜草中，Trp574位已發現2種由于突變產生的氨基酸替代方式，分別為亮氨酸和甘氨酸[16]。國外關于反枝莧抗性機制已有報道，McNaughton等發現Trp574被Leu替換導致反枝莧對咪唑乙煙酸和噻吩璜隆產生抗性[17]，這2種藥劑與嫩江縣長期大量使用的藥劑咪唑乙煙酸、氯嘧磺隆分別同屬咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑，本研究的結果與之相符。

非靶標位點的除草劑抗性可能由除草劑代謝機制的增強引起。對除草劑的代謝能夠最大程度地減少到達靶標位點的除草劑量，P450解毒酶和GSTs可能參與了這種機制[18-19]。本次試驗沒有對除草劑代謝進行研究，因此不能排除其對抗性產生的貢獻，這有待后續研究進行證實。

[1] 唐洪元. 中國北緯26°農田雜草的經相分布和危害[J].雜草學報,1987,1(2):8-10.

[2] 李曉晶,張宏軍,倪漢文. 反枝莧的生物學特性及防治[J].農藥科學與管理,2004,25(3):13-16.

[3] 魯萍,梁慧,王宏燕,等. 外來入侵雜草反枝莧的研究進展[J].生態學雜志,2010,29(8):1662-1670.

[4] 蘇少泉. 抗咪唑啉酮類除草劑作物的發展與未來[J].現代農藥,2006,5(1):1-4.

[5] Beckie H J, Tardif F J. Herbicide cross resistance in weeds[J]. Crop Protection, 2012,35:15-28.

[6] Yu Q, Powles S B. Resistance to AHAS inhibitor herbicides: current understanding [J]. Pest Management Science， 2014,70(9)：1340-1350.

[7] Powles S B, Yu Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides [J]. Annual Review of Plant Biology,2010,61:317-347.

[8] 孫會杰,紀明山,劉郁,等. 玉米田雜草反枝莧對莠去津的敏感性試驗研究[J].安徽農業科學,2007,35(17):5193.

[9] 黃媛媛,紀明山. 遼寧省不同地區的反枝莧對氯嘧磺隆抗藥性研究[J].江西農業學報, 2009, 21(4): 61-62.

[10]曹坳程. 一種快速、靈敏的除草劑生物測定方法[J].雜草學報,1992,6(2):16-22.

[11]Tal A, Kotoula-Syka E, Rubin B. Seed-bioassay to detect grass weeds resistant to acetyl coenzyme A carboxylase inhibiting herbicides [J]. Crop Protection, 2000, 19(7):467-472.

[12]Yang Caihong, Dong Liyao, Li Jun, et al. Identification of Japanese foxtail (Alopecurusjaponicus) resistant to haloxyfop using three different assay techniques [J].Weed Science,2007,55:537-540.

[13]Rajguru S N, Burgos N R, Shivrain V K, et al. Mutations in the red rice ALS gene associated with resistance to imazethapyr[J]. Weed Science, 2005, 53(5):567-577.

[14]Bernasconi P, Woodworth A R, Rosen B A, et al. A naturally occurring point mutation confers broad range tolerance to herbicides that target acetolactate synthase [J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(29): 17381-17385.

[15]Shaner D L. Resistance to acetolactate synthase (ALS) inhibitors in the United States: history, occurrence, detection, and management [J]. Journal of Weed Science and Technology, 1999, 44(4)： 405-411.

[16]Heap I M. The International survey of herbicide resistant weeds [EB/OL].[2014-05-17].www.weedscience.org.

[17]McNaughton K E, Letarte J, Lee E A, et al. Mutations in ALS confer herbicide resistance in redroot pigweed (Amaranthusretroflexus) and Powell amaranth (Amaranthuspowellii)[J]. Weed Science,2005,53(1):17-22.

[18]Vila-Aiub M M, Neve P, Powles S B. Resistance cost of a cytochrome P450 herbicide metabolism mechanism but not an ACCase target site mutation in a multiple resistantLoliumrigidumpopulation [J]. New Phytologist,2005,167(3):787-796.

[19]Li G, Wu S G, Yu R X, et al. Identification and expression pattern of a glutathioneS-transferase inEchinochloacrus-galli[J]. Weed Research, 2013, 53(5):314-321.

Imazethapyr resistance and its molecular resistance mechanism inAmaranthusretroflexusL.

Chen Jinyi1, Zhang Chaoxian1, Huang Hongjuan1, Wei Shouhui1, Liu Yan2，Huang Zhaofeng1，Chen Jingchao1, Yang Long1，Wang Xu1

(1.Institute of Plant Protection, Key Laboratory of Weed and Rodent Biology and Management,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences, Harbin 150038, China)

To evaluate resistance levels ofAmaranthusretroflexusL. to imazethapyr,an ALS inhibitor, seeds from Sichuan and Heilongjiang provinces in China were collected. Agar bioassays demonstrated that the GI50values of resistant(R) and susceptible(S) population were 52.26 and 11.20, respectively, and the resistance index was 4.67. Fragments encoding the ALS were amplified and cloned from S and R population and sequenced subsequently. The result showed that the nucleotide sequence of R population differed from that of the S population with one amino acid substitution of Leu (TTG)for Trp574(TGG) located in the highly conserved region Domain B. The substitution of Leu for Trp574 might be responsible for the resistance to imazethapyr in the R population ofA.retroflexus.

Amaranthusretroflexus; imazethapyr; resistance; mutation

2014-02-24

2014-06-18

公益性行業(農業)科研專項(201303022)

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.023

* 通信作者 E-mail: cxzhang@ippcaas.cn