湖南省南方水稻黑條矮縮病毒分離物組分S10編碼的ORF序列克隆與分析

李興華，凌曉曦，張松柏，張德詠,*，劉 勇,*

(1.中南大學(xué)研究生院隆平分院， 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所， 長(zhǎng)沙 410125)

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湖南省南方水稻黑條矮縮病毒分離物組分S10編碼的ORF序列克隆與分析

李興華1，凌曉曦2，張松柏2，張德詠1,2*，劉 勇1,2*

(1.中南大學(xué)研究生院隆平分院， 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所， 長(zhǎng)沙 410125)

采用RT-PCR方法擴(kuò)增并克隆了2013年湖南省水稻上發(fā)生的南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)S10片段的近全長(zhǎng)序列，采用生物信息學(xué)軟件Mega、RDP和DnaSP分析其編碼的開放閱讀框(open reading fragment，ORF)遺傳多樣性。結(jié)果表明：2013年湖南省15個(gè)SRBSDV分離物S10編碼的ORF序列同源性在99.5%以上，不同分離物中存在3～30個(gè)突變位點(diǎn)，絕大部分的核酸突變?yōu)闊o(wú)義突變，沒有發(fā)現(xiàn)可能的重組。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，15個(gè)分離物聚類為2個(gè)分支，其中湖南漢壽的10個(gè)分離物和永州的2個(gè)分離物(HuNyz12和HuNyz29)與我國(guó)浙江分離物聚為1個(gè)亞組、湖南永州的其他3個(gè)分離物與我國(guó)南部的云南、海南等及越南的分離物聚為1個(gè)亞組。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，SRBSDV隨傳毒介體白背飛虱遷飛從我國(guó)南部向北部擴(kuò)散。

南方水稻黑條矮縮病毒； 湖南分離物； 組分S10； 克隆與分析

南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)是近年來(lái)在我國(guó)南方稻區(qū)危害非常嚴(yán)重的病毒之一，屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)，斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)第2組的1個(gè)新種[1]。自2009年以來(lái)，由SRBSDV侵染引起的南方水稻黑條矮縮病，在我國(guó)南方稻區(qū)快速擴(kuò)展危害，僅2010年，在我國(guó)南方稻區(qū)的發(fā)生面積就達(dá)到120多萬(wàn)hm2，稻谷損失達(dá)到2.32億kg。湖南省2010年所有稻區(qū)均有SRBSDV危害，發(fā)生面積約53萬(wàn)hm2，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

SRBSDV由白背飛虱以持續(xù)性傳毒方式進(jìn)行傳播，主要危害水稻、玉米等禾本科作物[3]。病毒、寄主以及傳毒介體長(zhǎng)期的互作過程中，均會(huì)發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變[4]。研究表明，SRBSDV危害區(qū)域包括熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，這些地區(qū)的溫度差異大，水稻品種也具有一定差異，這些因素都可能影響傳毒介體和SRBSDV的適應(yīng)性。SRBSDV的序列分析結(jié)果也表明，SRBSDV的組分S1～S6的序列可能存在重組[5]。

然而迄今為止的大多數(shù)研究都表明，組分S9和S10的序列中不存在重組[6-8]。僅Li等[9]研究表明，SRBSDV的S10組分中存在重組，且第550位置的密碼子處于正選擇壓力下。組分S10編碼病毒外殼蛋白，該蛋白對(duì)于病毒的傳播擴(kuò)散以及在寄主體內(nèi)的運(yùn)輸非常重要，因此，研究組分S10編碼蛋白的遺傳變異，對(duì)于了解SRBSDV的進(jìn)化、適應(yīng)性具有非常重要的意義。

本研究選擇2013年采集的湖南省水稻主產(chǎn)區(qū)具有典型癥狀或疑似癥狀的水稻樣本，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后，克隆了染病的水稻樣本中SRBSDV的S10近全長(zhǎng)序列，分析了S10編碼的ORF序列的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 水稻樣品和試劑

水稻樣品于2013年采集自湖南省水稻主產(chǎn)區(qū)，水稻類型包括早稻、中稻和晚稻。采集的水稻樣品包括疑似SRBSDV侵染(38份)和具有典型癥狀(莖稈上沿葉脈有白色瘤狀物)(12份)的水稻，所有樣本保存于-80 ℃。

Trizol試劑、一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自TransGen(北京)。

1.2 總RNA抽提

水稻總RNA抽提采用Trizol法，具體步驟參考說明書。

1.3 水稻樣本RT-PCR檢測(cè)

水稻樣本RT-PCR檢測(cè)，參考Zhou等的方法[1]，以所提總RNA為模板，采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟參考說明書。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物S10-F：5′ CGCGTCATCTCAAAACTACAG-3′，S10-R：5′-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3′)[1]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.4 SRBSDV S10組分近全長(zhǎng)序列克隆

根據(jù)GenBank (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中SRBSDV S10全序列(JQ692581.1)，采用Oligo7[10]設(shè)計(jì)3對(duì)引物，以RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的水稻總RNA為模板，擴(kuò)增目標(biāo)片段包含SRBSDV S10的ORF及5′和3′部分非編碼區(qū)，引物序列見表1，擴(kuò)增片段的大小分別為716、719和845 bp。

表1 引物序列

1.5 序列測(cè)定與分析

所有PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，測(cè)序獲得的序列利用ntBLAST進(jìn)行比對(duì)(http:∥blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用ORFfinder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定S10編碼的ORF。序列聯(lián)配、突變位點(diǎn)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用Mega 4.0軟件[11]。重組分析采用RDP 4軟件[12]，遺傳穩(wěn)定性分析采用DnaSP 5.01軟件[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻樣品RT-PCR檢測(cè)

2013年采集的水稻樣品(50份)經(jīng)RT-PCR檢測(cè)表明，有24份樣品擴(kuò)增得到預(yù)期目的條帶，其中12份具有典型癥狀的水稻樣本均擴(kuò)增得到預(yù)期目的條帶。測(cè)序結(jié)果表明，目的條帶與NCBI中其他SRBSDV分離物對(duì)應(yīng)的序列同源性很高(>98%)。

2.2 SRBSDV S10序列克隆

以24份SRBSDV陽(yáng)性水稻樣品總RNA為模板，利用設(shè)計(jì)的3對(duì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的3對(duì)引物均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的單一目的條帶。

24份樣品中有15份樣品經(jīng)測(cè)序成功獲得3個(gè)目的條帶的序列，其中S10編碼的ORF序列登錄信息見表2。

表2 SRBSDV陽(yáng)性樣品S10序列

2.3 SRBSDV S10編碼的ORF序列分析

2.3.1 突變位點(diǎn)分析

序列聯(lián)配結(jié)果表明，SRBSDV的15個(gè)湖南分離物S10 的ORF核酸序列都具有數(shù)目不一的突變位點(diǎn)，其中以SRBSDV-HuNhs 4的突變位點(diǎn)最多，有30個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變。S10編碼ORF的序列推導(dǎo)蛋白的聯(lián)配結(jié)果表明，僅有少量核苷酸突變位點(diǎn)，導(dǎo)致其編碼的氨基酸突變。DnaSP軟件分析結(jié)果也證實(shí)，15個(gè)湖南分離物S10 的ORF發(fā)生突變，并不會(huì)影響其遺傳穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)未顯示)。

S10 ORF的核酸序列的轉(zhuǎn)換/顛換率為k1=12.708 (嘌呤)和k2=28.817 (嘧啶)，整體轉(zhuǎn)換/顛換偏差為R=9.204, 序列變異偏好A/G 或C/T的轉(zhuǎn)換(表3)。

表3 S10 ORF堿基替換最大可能性分析

2.3.2 重組分析

利用RDP 4軟件的6種算法(RDP、Geneconv、3Seq、SiScan、Bootscan和Chimaera)對(duì)湖南15個(gè)SRBSDV分離物的S10 ORF進(jìn)行了重組分析，結(jié)果表明，在S10的ORF中沒有檢測(cè)到重組現(xiàn)象。

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

S10 ORF的序列同源性分析結(jié)果表明，湖南省15個(gè)分離物的序列同源性大于99.5%；與海南、湖北、廣西、廣東、江西、浙江、江蘇、安徽、云南、山東和越南分離物的同源性大于99%；與重慶、福建和貴州分離物的序列同源性大于98%。S10 ORF的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，15個(gè)湖南分離物的S10編碼的ORF序列可分為2個(gè)亞組，湖南永州的3個(gè)分離物聚為亞組Ⅰ，大多數(shù)SRBSDV分離物為我國(guó)南部的分離物(海南HaiN、云南YN)和越南分離物；湖南漢壽的10個(gè)分離物和永州的2個(gè)分離物(HuNyz12和HuNyz29)聚為亞組Ⅱ，相對(duì)于亞組Ⅰ，該亞組的分離物大多數(shù)為我國(guó)北方分離物(浙江ZJ)。值得注意的是，在亞組Ⅱ中，還包含湖南永州的2個(gè)分離物(HuNyz12和HuNyz29)處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支。

系統(tǒng)發(fā)育分析的地區(qū)劃分以北緯30o為分界線，湖南永州位于南部、漢壽位于北部。位于湖南最南部的永州市3個(gè)SRBSDV分離物，與我國(guó)南部稻區(qū)的分離物(海南HaiN、云南YN)和越南分離物聚為1個(gè)亞組；而位于湖南最北部的漢壽縣的10個(gè)SRBSDV分離物和永州的2個(gè)分離物(HuNyz12和HuNyz29)聚為亞組Ⅱ，該亞組包含的SRBSDV的分離物大多數(shù)為我國(guó)北方分離物(浙江ZJ)。該結(jié)果表明，SRBSDV S10編碼的ORF的序列具有一定的地域差異。值得注意的是，在亞組Ⅱ中，還包含湖南永州的2個(gè)分離物(HuNyz12和HuNyz29),處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支，該結(jié)果表明，湖南漢壽和永州的SRBSDV S10編碼的ORF序列存在相關(guān)性，這2個(gè)分離物可能是聯(lián)系亞組Ⅰ和亞組Ⅱ的“橋梁”。

系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果還表明，我國(guó)北部的SRBSDV分離物絕大多數(shù)聚在亞組Ⅱ，僅4個(gè)分離物聚在亞組Ⅰ，占亞組Ⅰ的9.7%；而我國(guó)南部SRBSDV分離物大部分聚在亞組Ⅰ，有8個(gè)聚在亞組Ⅱ，占亞組Ⅱ的29.6%；這表明我國(guó)南部的SRBSDV分離物的多樣性高于北部。

圖1 SRBSDV S10 ORF系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of SRBSDV S10 ORFs

3 討論

SRBSDV僅由白背飛虱傳播、擴(kuò)散危害[3]，因此，現(xiàn)有的南方水稻黑條矮縮病毒的分離物有著高同源性和低變異度，揭示了南方水稻黑條矮縮病毒來(lái)源單一的特點(diǎn)[14]。湖南省15個(gè)SRBSDV分離物的S10 ORF同源性非常高(>99.5%)，與其他研究報(bào)道的結(jié)果一致，并且這15個(gè)分離物與其他省份的SRBSDV的S10 ORF的同源性大于98%，表明湖南省的SRBSDV與其他省份的來(lái)源一致。然而，對(duì)于南方水稻黑條矮縮病毒的起源地，目前還沒有直接的研究證據(jù)。

湖南省15個(gè)SRBSDV-S10的ORF高度同源(>99.5%),與我國(guó)其他省份和越南分離物的同源性也非常高(>98%)，然而，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，湖南省15個(gè)SRBSDV-S10的ORF可以分為2個(gè)亞組(圖1)，表明SRBSDV在湖南省的傳播擴(kuò)散過程中，也存在進(jìn)化壓力[4]。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果還表明，湖南省SRBSDV 15個(gè)分離物的多樣性，與我國(guó)其他地區(qū)SRBSDV的多樣性趨勢(shì)一致，均是南部SRBSDV分離物的多樣性高于北部(圖1)。而SRBSDV的傳毒介體白背飛虱，研究表明，也是從東南亞和/或我國(guó)南部向北部遷飛[15]，該結(jié)果暗示，SRBSDV傳播擴(kuò)散與傳播介體白背飛虱的遷移類似，也是從我國(guó)南部向北部遷移。這與白背飛虱是目前已知的SRBSDV唯一傳毒介體的研究結(jié)論一致[3]。

在植物病毒的進(jìn)化中，突變、重組、重排等發(fā)揮主要的作用，從而使病毒適應(yīng)寄主、環(huán)境等因素的變化，增強(qiáng)致病性，有利于病毒的擴(kuò)展危害[4]。對(duì)SRBSDV的研究表明，在S1、S2、S4、S5、S6中發(fā)現(xiàn)了重組現(xiàn)象[5]。然而，對(duì)絕大多數(shù)S10序列的突變、重組等研究表明，S10不存在重組現(xiàn)象[7-8]。僅Li等[9]利用生物學(xué)軟件HYPHY發(fā)現(xiàn)SRBSDV的S10組分中存在重組，且第550位置的密碼子處于正選擇壓力下，作者指出，該結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)論與大多數(shù)研究結(jié)論一致，表明湖南省分離物S10編碼的ORF遺傳非常穩(wěn)定。然而，湖南省分離物S10編碼的ORF也存在一些位點(diǎn)突變，雖然僅有3～5個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸殘基突變，但是，該結(jié)果暗示，湖南省分離物S10編碼的ORF，在隨白背飛虱遷入湖南后，因寄主、環(huán)境因素等的影響，也存在進(jìn)化壓力，這種進(jìn)化是否對(duì)SRBSDV的群體產(chǎn)生影響、產(chǎn)生何種影響以及對(duì)病害的防控有何啟示尚需進(jìn)行跟蹤監(jiān)控和進(jìn)一步的深入研究。

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Sequences cloning and analysis of ORF of fragment S10 in Hunan isolates ofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus

Li Xinghua1, Ling Xiaoxi2, Zhang Songbai2, Zhang Deyong1,2, Liu Yong1,2

(1. Longping Branch, Graduate College, Central South University, Changsha 410125, China;2. Hunan Plant Protection Institute, Changsha 410125, China)

The nearly full-length of the genome segment 10 (S10) ofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV) isolates sampled in 2013 in Hunan Province was cloned and sequenced. The identity of 15 isolates of S10 ORF was higher than 99.5%. There were 3-30 mutation positions, nevertheless most of them were nonsense, and there was no putative recombination event in ORF of S10 sequences of 15 isolates. The results of phylogenetic analysis showed ORFs of S10 of 15 isolates were divided into two clusters, 10 isolates of Hanshou County and 2 isolates of Yongzhou County and those isolates of Zhejiang Province in cluster one, and the others 3 isolates of Yongzhou County and those isolates of South of China and Vietnam in cluster two. Phylogenetic analysis showed SRBSDV was transmitted by white back planthopper from Southern to Northern of China.

Southernriceblack-streakeddwarfvirus; Hunan isolates; segment S10; cloning and analysis

2014-07-25

2014-12-16

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003031)

S 435.111; S 434.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.024

* 通信作者 E-mail: dyzhang78@163.com; haoasliu@163.com