人面果口山酮抗糖尿病活性的篩選

王朝元，田世婷，陳 玉

(1中南民族大學生命科學學院，武漢430074;2中南民族大學化學與材料科學學院，武漢430074)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種由遺傳因素和環境因素共同作用所致的慢性全身性代謝性內分泌疾病.近年來，糖尿病及其各類并發癥的發病率普遍增高，其中以胰島素分泌相對不足為特征的II型糖尿病患者占絕大多數［1］.傣藥人面果(Garcinia xanthochymus)為我國傳統傣藥，是藤黃科藤黃屬植物，該屬植物廣泛分布于亞洲熱帶地區，全世界共約400多種，其中我國產30余種.人面果其莖、葉、根、果實、漿汁、莖皮和種子均可入藥，在傳統醫學中主要應用于治療上火發熱、食物中毒、痢疾腹瀉等疾病［2］，其主要化學成分為酮類［3，4］、酯類化合物［5］等.酮類化合物為近代天然產物中的一類重要活性成分，藥理研究表明:該類化合物具有廣泛的藥理活性，包括利尿、抗微生物、抗病毒、強心、抗憂郁、抗結核、抗癌、抗肝毒等;多數酮還能抑制單胺氧化酶A和B.此外，它還具有抗白血病、中樞神經系統鎮靜及抗炎、抑制脂質氧化等作用［6］.目前，對來源于藤黃屬植物中的酮類化合物的抗糖尿病研究已有一些報道［7，8］.本課題組在前期從人面果樹皮中分離出了一系列酮類化合物，并對其抗氧化活性進行了報道［9-11］.本文采用高濃度牛胰島素(100 mg·L－1)作用于 HepG2細胞24 h，建立了穩定的胰島素抵抗的HepG2細胞模型(HepG2/IR細胞)，利用葡萄糖氧化酶法研究了各化合物對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗的影響，以期篩選出具有抗糖尿活性的新的酮類化合物.

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑和儀器

單體化合物1～5由中南民族大學藥學院天然產物化學研究室從人面果中提取分離得到，通過MS、NMR和2D-NMR等技術鑒定其結構(見圖1和表1).HepG2人肝細胞株(購于武漢大學細胞培養保藏中心).

DMEM高糖培養基及胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，牛胰島素(Sigma公司)，葡萄糖檢測試劑盒(北京金豪制藥股份有限公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，BIOSHARP公司)，二甲雙胍(Metformin，北京中惠藥業有限公司)，0.25%胰蛋白酶(含 EDTA，以色列 Bioind公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司).

CO2培養箱(371型，Thermo公司)，多功能酶標儀(354型，Thermo公司)，倒置顯微鏡系統(DMIL型，德國Leica公司)，潔凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司)，高壓滅菌器(MLS-3780型，日本 SANYO公司)，微量加樣器(Research Plus，德國Eppendorf公司)，電子分析天平(BS21S型，德國Sartorious公司).

圖1 人面果中酮化合物1～5的結構Fig.1 The structures of xanthone compounds 1～5 isolated from Garcinia xanthochymus

表1 不同人面果中的酮化合物1～5的英文名稱Tab.1 The English names of xanthone compounds 1～5 isolated from Garcinia xanthochymus

表1 不同人面果中的酮化合物1～5的英文名稱Tab.1 The English names of xanthone compounds 1～5 isolated from Garcinia xanthochymus

酮化合物英文名稱文獻1 1，3，5，6-tetrahydroxy-4，7，8-tri(3-methyl-2-butenyl)xanthone［9］2［9］3 garcinexanthone B［10］garcinenone E 4［10］5 3，4-dihydro-3，6，7，11-tetrahydroxy-8，9-di-(3-methyl-2-butenyl)-2，2-dimethyl-pyrano-［2，3-c］xanthone［11］garcinexanthone D

1.2 HepG2細胞的體外培養

復蘇HepG2細胞培養在含10%FBS的高糖DMEM培養基的細胞瓶中置于5%CO2，37℃恒溫箱，培養至單層細胞貼壁，每3天傳代1次.

1.3 HepG2細胞胰島素抵抗模型(HepG2/IR)的建立

取對數生長期細胞，用含10%FBS 的高糖DMEM制成細胞懸液使其濃度為105個/mL，接種于96 孔板，每孔 100 μL，于 37℃，5%CO2條件下培養至細胞單層貼壁80%～90%，換100 μL無血清DMEM饑餓處理12 h，使細胞同步化.吸棄培養基，加入新鮮配制含牛胰島素濃度為100 mg·L－1的2%FBS培養基200 μL，以不含牛胰島素2%胎牛血清為正常對照組，每組設6個復孔，于5%CO2，37℃恒溫培育 24 h［12］.

取對數生長期細胞，用含10%FBS的DMEM配成終濃度為105個/mL的細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板中，于37℃，5%CO2條件培養12 h，吸棄培養基，加入新鮮配制含不同濃度的各化合物的無血清培養基200 μL.實驗細胞分為正常對照組(不含待測化合物，含0.1%DMSO)，含待測化合物(化合物1、2、5 設濃度為 50，100，200，400 μmol·L－14組，化合物 3、4設濃度為 25，50，100，200 μmol·L－14組)共5組細胞.各組藥均以DMSO助溶(終濃度小于0.1%).培養24 h后，棄上清液，每孔加入 MTT溶液 100 μL(終濃度為 0.5 mg·mL－1)［13］，繼續培養 3 h 后，棄上清，每孔加入 100 μL DMSO，用酶標儀震蕩15 s，在492 nm處測 OD值并計算細胞存活率，細胞存活率=(不同濃度給藥組細胞OD值/正常細胞OD值)×100%.

如1.2.2方法建立胰島素抵抗細胞模型，培養24 h后，吸棄培養基，正常對照組加入200 μL新鮮含0.1%DMSO的無血清DMEM培養基，陽性藥組加入200μL新鮮含二甲雙胍(Metformin)的無血清DMEM，給藥組加入200 μL含不同濃度的待測化合物的無血清DMEM，另設無細胞空白對照組，僅加入200μL無血清 DMEM培養基組.各組于37℃，5%CO2條件下培育24 h后，吸取細胞培養上清液2 μL，采用葡萄糖氧化酶法檢測各組細胞葡萄糖消耗量(GC).培養基中葡萄糖含量=A樣品/A標準葡萄糖溶液×5.55，A 為各組在505 nm 處的OD 值，標準葡萄糖試劑的葡萄糖含量為5.55 moL·L－1.葡萄糖消耗量(GC)=空白培養基葡萄糖含量–各組的培養基葡萄糖含量.并用MTT法測定各組細胞活力，以GC/MTT值(GC/MTT=葡萄糖消耗/MTT OD值)評價化合物對HepG2/IR模型細胞葡萄糖消耗的影響.

1.6 統計學分析

2 結果與分析

50～400 μmol·L－1的化合物 1、2、5 和 25～200 μmol·L－1的化合物3、4 作用于 HepG2 細胞 24 h后，化合物對HepG2的細胞毒性作用如圖1所示，圖1 中化合物1、2、5 以最低濃度50 μmol·L－1處理細胞后細胞存活率均未達到85%，化合物3、4在濃度以25 μmol·L－1處理后細胞存活率約為85%，推斷各化合物在濃度低于25 μmol·L－1對 HepG2細胞無毒.故設定 6.25～25.00 μmol·L－1作為后續實驗的參考濃度范圍.各化合物的 IC50值如表2所示.

圖2酮化合物1～5對HepG2細胞存活率的影響Fig.2 The effect of xanthone compounds 1～5 on the survival rate of HepG2 cell

表2酮化合物1～5作用于HepG2細胞24h時的IC50值Tab.2 IC50values of HepG2 cells treated with xanthone compounds 1～5 for 24 h

表2酮化合物1～5作用于HepG2細胞24h時的IC50值Tab.2 IC50values of HepG2 cells treated with xanthone compounds 1～5 for 24 h

酮化合物 IC50/(μmol·L－1)1 72.74 ±1.54 2 66.07 ±2.51 3 156.53 ±9.63 4＞200 5 104.52 ±3.33

圖3 化合物對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗的影響Fig.3 The effect of xanthone compounds 1～5 on the glucose consumption in HepG2/IR cells

3 討論

胰島素抵抗(Insulin-resistant，IR)是指機體靶組織對胰島素促進葡萄糖消耗利用的效應產生了抵抗［14］.肝臟和肌肉組織是胰島素作用的主要靶組織，也是產生胰島素抵抗的最主要部位.肝臟在糖代謝中起著極為重要的作用，也是胰島素受體最密集的臟器之一，對胰島素的促糖代謝作用極為敏感［15］.HepG2細胞系來源于人肝細胞的一種表型，它是與正常肝細胞甚為相似的肝胚胎瘤細胞株，該細胞既保留了肝細胞的眾多生物學特性，又便于體外培養，因此常用HepG2細胞建立胰島素抵抗模型細胞.本文采用高濃度胰島素(100 mg·L－1)誘導HepG2細胞24 h產生胰島素抵抗，結果表明:胰島素誘導HepG2細胞的葡萄糖消耗量明顯降低，成功建立了HepG2/IR模型.

本文以HepG2/IR細胞為篩選模型，對來源于人面果中的酮類化合物1～5進行抗糖尿病活性篩選，結果顯示:化合物1，3，4均具有較強的提高HepG2/IR模型細胞葡萄糖消耗量的作用，化合物3和4抗糖尿病活性最強，優于常用藥物二甲雙胍，為后續進一步探討人面果酮類化合物抗糖尿病作用的機制奠定了基礎.

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