抗癌方有效部位群對荷瘤小鼠免疫功能的影響

李 雅，楊 茹，聶 磊，范引科，謝人明

（1．陜西省腫瘤醫院，西安710061；2．陜西省中醫藥研究院，西安710003）

抗癌方有效部位群對荷瘤小鼠免疫功能的影響

李 雅1，楊 茹1，聶 磊1，范引科2，謝人明2

（1．陜西省腫瘤醫院，西安710061；2．陜西省中醫藥研究院，西安710003）

目的 觀察抗癌方有效部位群對荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法 通過S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能試驗、S180荷瘤小鼠溶血素試驗、小鼠肝癌瘤株NK細胞活性試驗，觀察抗癌方對S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能、S180荷瘤小鼠溶血素、C57小鼠肝癌瘤株NK細胞活性的影響。結果 抗癌方能夠增強荷瘤小鼠網狀內皮系統的吞噬功能，促進荷瘤小鼠溶血素抗體生成，增強小鼠脾臟NK細胞活性。結論 抗癌方可顯著提高荷瘤小鼠免疫功能，增強NK細胞活性是其可能機制之一。

抗癌方；免疫功能；自然殺傷細胞

惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的疾病之一，我國已進入老齡化社會，腫瘤發病率及病死率呈高發趨勢，從天然植物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分藥物仍是近年來國內外學者熱衷的研究課題［1-5］。抗癌方有效部位群（簡稱抗癌方）出自我院名老中醫驗方，由蟾皮、莪術、延胡索等諸藥經提取、純化得到有效部位成分配伍組合而成。臨床觀察證實用于肝癌、胃癌等多種腫瘤及癌痛的治療具有較好效果［6-10］。筆者通過免疫實驗等系列全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機理，為闡明其科學內涵，進一步臨床應用提供充分的科學依據。

1 實驗材料

1.1 受試藥物 名稱：抗癌方，由蟾皮、莪術、延胡索等諸藥經提取、純化得到有效部位成分配伍組合而成 ，約含蟾毒配基類化合物4.39%，莪術揮發油20.00%，異喹啉生物堿5.98%，1 g藥粉相當3.02 g原生藥。

1.2 陽性藥物 注射用環磷酰胺：國藥準字H14023686，山西普德藥業股份有限公司生產，規格：0.2 g。成人常用量：單藥靜脈注射按體表面積每次500～1 000 mg／m2，加生理鹽水20～30 mL，靜脈注射，每周1次，連續2次，休息1～2周重復聯合用藥500～600 mg／m2。轉移因子口服液：國藥準字H20013288，由金花企業（集團）股份有限公司，金花制藥廠生產，規格10 mL∶10 mg／kg，10～20 mL／次，2～3次／d口服。

1.3 瘤株 小鼠S180肉瘤細胞株，肝癌細胞，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.4 實驗動物 KM小鼠，西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（陜）2010-001。C57 BL／6小鼠，第四軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（軍）2010-007。

1.5 試劑 印度墨汁：北京篤信精細制劑廠生產，規格100 mL／瓶，批號0100426。2%冰醋酸溶液：西安化學試劑廠生產，批號110512。氯化鈉注射液：四川科倫藥業股份有限公司生產，規格250 mL／瓶，國藥準字H61020014。標準胎牛血清，Gibco，上海科興商貿有限公司。二甲基亞砜（DMSO），美國Fisher Chemica公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT），西安舟鼎國公司。刀豆蛋白A（ConA），西安舟鼎國公司。胰蛋白酶消化液，西安舟鼎國公司。RPMI-1640，Gbico公司。96孔培養板，美國Corning公司。

1.6 儀器 電子天平：型號（BSA224S-CW），北京賽多利斯天平廠。光學顯微鏡：olympus CX22LED，奧林巴斯生產。雙人凈化工作臺，SW-CJ-2D型，蘇州凈化設備有限公司生產。高速低溫離心機：型號centrifuge 5810R。潔凈工作臺：Taisite。TDZ4AWS臺式低速自動平衡離心機。恒溫培養箱：Heraeus。酶標儀：BIORAD Model 680 serial NO.13628 Made in Japan。

2 方法

2.1 抗癌方對S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 按文獻［11-12］方法，ICR小鼠60只，雌雄各半，體質量18～22 g，取生長良好的腹水型腫瘤小鼠，脫臼處死，潔凈臺無菌操作制備瘤細胞液 ，計數池計數細胞濃度為1×107個／mL，每只小鼠腹腔接種0.2 mL瘤細胞液，即接種2×106個瘤細胞。24 h后隨機分為6組，空白對照組，環磷酰胺組（使荷瘤小鼠免疫低下），陽性對照組，抗癌方大、中、小劑量組（1.00、0.50、0.25 g／kg）。除正常對照組外，其他各組小鼠肌肉注射環磷酰胺20 mg／kg造模，連續注射5 d。造模同時，陽性對照組灌胃轉移因子口服液10 mL／kg，其他3組分別給抗癌方，各組灌胃體積均為10 mL／kg，1次／d，連續給藥10 d。末次給藥后小鼠稱重 ，10%印度墨汁生理鹽水0.1 mL／10 g尾靜脈注入后分別于2、12 min用微量移液器內眥靜脈取血20 μL，立刻加入到0.1% Na2CO3溶液2 mL中混勻。以對照管作為空白，721分光光度計680 nm處測定各管OD值。同時取小鼠肝、脾稱重，按公式計算吞噬指數κ及吞噬系數α值。

2.2 抗癌方對S180荷瘤小鼠溶血素的影響 按文獻［11-12］方法，選健康ICR小鼠60只，摟2.1分組給藥。首次給藥前腹腔注射0.2 mL 10%綿羊紅細胞懸液進行免疫。末次給藥后1 h，小鼠眼眶取血0.5 mL，1 500 r／min，離心10 min，吸取血清稀釋10倍，取稀釋血清1 mL，與5%綿羊紅細胞懸液0.5 mL，10%補體1 mL混勻。37℃水浴中放置10 min后取出，孵畢取出終止反應。2 000 r／min，離心10 min，取上清液1 mL加3 mL都氏試劑混勻，540 nm處以對照管作為空白，分別測定各管OD值，組間比較 t檢驗。

2.3 抗癌方對C57小鼠肝癌瘤株NK細胞活性的影響 按文獻［11-12］方法，取C57 BL／6小鼠50只，雄性，體質量18～22 g，取種瘤小鼠制備瘤細胞懸液（1×107／mL），于右前肢腋窩皮下接種2×106個瘤細胞懸液。24 h后隨機分為5組：荷瘤對照組、環磷酰胺對照組、抗癌方大、中、小劑量組。荷瘤對照組灌胃蒸餾水。環磷酰胺對照組灌胃環磷酰胺（20 mg／kg），抗癌方大、中、小劑量分別為1.00、0.50、0.25 g／kg。各組灌胃體積均為10 mL／kg，連續給藥14 d，末次給藥后1 h，稱小鼠體質量，眼球放血后頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，研磨，沙網過濾（200目），加入紅細胞裂解液（無菌雙蒸水），裂解3 min，1 000 r／min離心10 min，取出淋巴細胞，生理鹽水沖洗2次，用RPMI-1640培養液調細胞濃度為 5×106／mL，于 37 ℃5%CO2飽和濕度培養備用。

將制備調密度為3.1×106／mL的脾細胞懸液與用培養液調密度為1.4×105／mL的靶細胞L929，以25∶1比例接種于96孔培養板，每只小鼠均設6孔，其中5孔加入效應細胞和靶細胞總體積200 μL，充分混勻；1孔為效應細胞對照，加入效應細胞和RPMI-1640（含10%小牛血清）各100 μL；設靶細胞對照，加入靶細胞和RPMI-1640各100 μL；于37℃5%CO2條件培養20 h后取出，吸出上清；每孔加入MTT（5 mg／mL）試液10 μL，繼續孵育4 h，吸出上清；每孔加入DMSO 100 μL，充分振蕩，用酶聯免疫檢測儀在570 nm測吸收度。記錄OD值。

3 結果

3.1 抗癌方對S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 見表1。

表1 抗癌方對S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±s，n＝10）

表1 抗癌方對S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±s，n＝10）

注：與環磷酰胺組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

／α荷瘤對照組 10mL／kg 2．42±0．45 4．76±0．78＃環磷酰胺組 20 2．08±0．42 3．68±0．98轉移因子組 10 2．12±0．21 5．25±0．72＃＃抗癌方大組 1．00 g／kg 2．32±0．32 4．71±0．41＃抗癌方中組 0．50 g／kg 2．26±0．45 4．36±0．75＃抗癌方小組 0．25 g／kg 2．29±0．26 4．07±0．68組 別 劑量／（mg／kg） 肝脾重／g 吞噬系數

3.2 抗癌方對S180荷瘤小鼠溶血素的影響 見表2。

表2 抗癌方對S180荷瘤小鼠溶血素的影響（±s，n＝10）

表2 抗癌方對S180荷瘤小鼠溶血素的影響（±s，n＝10）

注：與環磷酰胺組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 劑量／（mg／kg） OD值荷瘤對照組 10mL／kg 0．085±0．031＃＃環磷酰胺組 20 0．032±0．021轉移因子組 10 0．096±0．029＃＃抗癌方大組 1.00 g／kg 0．076±0．032＃＃抗癌方中組 0.50 g／kg 0．062±0．056＃抗癌方小組 0.25 g／kg 0．051±0．024＃

3.3 抗癌方對C57小鼠肝癌瘤株NK細胞活性的影響 見表3。

表3 抗癌方對小鼠肝癌瘤株NK細胞活性的影響（±s，n＝10）

表3 抗癌方對小鼠肝癌瘤株NK細胞活性的影響（±s，n＝10）

注：與荷瘤對照組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 劑量／（mg／kg） OD值荷瘤對照組 10mL／kg 11．38±19．42環磷酰胺組 20 7．25±14．38抗癌方大組 1.00 g／kg 34．23±16．03＃＃抗癌方中組 0.50 g／kg 29．22±18．56＃抗癌方小組 0.25 g／kg 23．65±12．69＃

4 小結

本研究結果表明：1）抗癌方能明顯加強荷瘤小鼠的巨噬細胞碳粒廓清能力；2）對免疫低下荷瘤小鼠溶血素抗體生成有促進的作用；3）具有增強小鼠脾臟NK細胞活性的作用。實驗結果提示抗癌方能夠顯著升高荷瘤小鼠網狀內皮系統的吞噬功能，具有增強機體非特異性免疫功能的作用；對荷瘤小鼠溶血素抗體生成有促進作用，能夠提高機體體液免疫功能；提示抗癌方具有增強小鼠脾臟NK細胞活性的作用。綜合評價抗癌方具有增強荷瘤小鼠免疫功能的作用；抗癌方通過增強小鼠脾臟NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性是其增強機體免疫功能的機制之一；抗癌方具有通過增強機體免疫功能發揮抗腫瘤的作用。抗癌方中多種中藥來源的化學成分不僅對腫瘤細胞具有直接的細胞毒殺傷作用，而且能夠從不同途徑提高腫瘤患者的免疫功能，在“祛邪”的同時且能“扶正”［13-17］。筆者將繼續通過協同增效等實驗進一步全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機理，為臨床應用提供充分的科學依據。

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Effective parts of anticancer prescription on immune function of tumor-bearing mice

LI Ya1，YANG Ru1，NIE Lei1，FAN Yinke2，XIE Renming2
（1．Department of Medical Oncology，Shaanxi Provincial Tumor Hospital，Xian 710061，China；2．Shaanxi Institute of Trational Chinese Medicine，Xian 710003，China）

Objective To observe the immune effects of anticancer prescription effective parts on tumor-bearing mice．Methods To observe anticancer prescription effective parts effects on immune function of tumor-bearing mice，by the macrophage phagocytic function of S180tumor-bearing mice in experiment of peritoneal，S180tumor-bearing mice hemolysin test，C57 mice liver cancer tumor strains of NK cell activity test．Results Anticancer prescription effective parts can enhance the phagocytic function of reticuloendothelial cells in tumor-bearing mice．To promote the formation of hemolysin antibody in tumor-bearing mice，enhance NK cell activity of spleen in tumor-bearing mice．Conclusion Anticancer prescription significantly improving the immune function of tumor-bearing mice and promoting the activity of NK cell is one of the possible mechanisms．

anticancer prescription；immune function；NK cell

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0922-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．014

2015-07-20）

陜西省中醫管理局課題“抗癌方有效部位群抗腫瘤作用的研究”（2012-JC18）。

李 雅（1975-），女，醫學碩士，主治醫師，主要從事內科腫瘤臨床研究。