小黑麥花粉干燥法超低溫保存技術研究

徐翠蓮 王瑞清 張俐敏 田依軒 胡文明

摘要：為了滿足種質資源保存、交換及雜交育種工作的需求，對小黑麥花粉活力及影響小黑麥花粉超低溫保存效果的因素進行了研究。結果表明，采用TTC染色法測定小黑麥花粉的活力，結果相對準確，且其適合的濃度為0.1%；采用硅膠干燥處理3 h后，小黑麥花藥相對含水量為34.5%，比較適合超低溫保存，且保存前后花粉活力保持穩定，其活力相對保持率為92.3%；超低溫冷凍保存5 d后，采用不同的化凍方式進行化凍，結果發現自來水沖洗化凍后小黑麥花粉活力相對較高，說明自來水沖洗化凍是簡便適合的化凍方式。

關鍵詞：小黑麥；花粉活力；花粉相對含水量；超低溫保存；化凍方式

中圖分類號：S512.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5223-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.006

Studies on Cryopreservation of Triticale Pollen after Drying Treatment

XU Cui-lian， WANG Rui-qing， ZHANG Li-min， TIAN Yi-xuan. HU Wen-ming

（College of Plant Science， Tarim University， Alar 843300， Xinjiang， China）

Abstract： In order to meet the demands of germplasm resources preservation， exchange and cross breeding， triticale pollen vitality and the cryopreservation-influencing factors were studied in this research. The results showed that， TTC staining method was relatively accurate for determining the triticale pollen vitality， and the suitable concentration was 0.1%； moreover， it was more suitable for cryopreservation when relative water content of anther reached to 34.5% after dried three hours by silica gel， which made pollen vitality stable and its vitality relative retention rate was 92.3%.In addition， different ways of defrosting were studied after five days of cryopreservation， and the results showed that the pollen vitality was relatively high when adopting method of tap water washing， indicating that tap water defrosting was more simple and applicable.

Key words： triticale； pollen vitality； relative water content of triticale anther； cryopreservation； ways of defrosting

花粉是種子植物特有的生殖器官的一部分。花粉活力指成熟的花粉在離體條件下存活且一段時間內授粉具備結實能力。然而不同植物花粉活力持續的時間長短不同，即壽命不同。因此，充分了解植物花粉的生活力特性在植物種質資源保存等研究中具有重要的意義。

花粉壽命的長短，除受到遺傳因素決定外，還受環境的影響[1，2]。其中對花粉活力影響較大的環境因素是貯藏溫度和花粉本身的含水量。花粉貯藏常見的方法有低溫干燥法、真空貯藏法、凍干貯藏法、超低溫貯藏法、有機溶劑保存法等。其中超低溫貯藏法利用液態氮將花粉貯藏在-196 ℃條件下，被認為是目前實現花粉種質“永久”的最理想的方法之一。花粉的超低溫保存能解決諸如制種中花時花期不遇的問題，能使不同時間開花、花期不一致的植物正常授粉結實，也能使不同地點開花的植物實現正常的授粉結實。花粉的超低溫保存技術在果樹、林木[3，4]和花卉[5-8]中研究或應用較多，但在作物中研究的較少[9-11]。

禾本科植物花粉壽命很短，一般在開花散粉后幾個小時內花粉活力降低很快，不利于花粉活力研究和育種工作的開展。因此，采用超低溫冷凍技術延長花粉壽命為麥類遠緣雜交育種和種質資源的保存、交流提供便捷的途徑，有一定的應用價值。鑒于目前超低溫保存技術在保存植物花粉中的應用可以發現，花粉材料的種間特異性很強，不同種植物的花粉超低溫保存可能需要不同的技術方案，還沒有找到一種可以適用于所有花粉超低溫保存的技術方案。本研究擬對不同小黑麥品種的花粉進行超低溫保存研究，旨在確立小黑麥花粉超低溫冷凍保存的技術，為小黑麥育種，尤其是跨時間、跨地區的雜交育種提供方便，同時為禾本科花粉的長期冷凍保存提供理路依據和技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗條件

供試材料為新小黑麥1號、新小黑麥3號、新小黑麥4號和新小黑麥5號，由石河子大學麥類作物研究所提供。試驗于2012—2013年在塔里木大學園藝試驗站和園藝實驗室進行。采用隨機區組試驗設計，重復2次，每小區種植10行，行長3 m，行距15 cm，四周設保護行。試驗地肥力中等，試驗田基施220 kg/hm2尿素、150 kg/hm2磷酸二銨，拔節期隨水施80 kg/hm2尿素、60 kg/hm2 KH2PO4，揚花灌漿期施70 kg/hm2尿素、60 kg/hm2 KH2PO4。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉活力及花藥相對含水量測定 于小黑麥揚花期的晴天上午10：00左右，選取長勢一致、當日待開花散粉的麥穗20個，減去1/3穎殼，用鑷子撥出花藥，備用。將花藥裝入1.5 mL離心管，采用室溫自然干燥（A）和干燥皿內硅膠干燥（B）2種方法進行干燥，每隔1 h分別取少許花粉進行花粉活力及含水量測定，其余的用于超低溫保存，以未經干燥處理的花粉及花粉直接投入液氮進行超低溫保存為對照。

花粉活力測定：取少許花粉于載玻片上，分別采用碘-碘化鉀（I2-KI）溶液、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，以75%乙醇處理的花粉為對照。每個處理制作2～3個制片，于30 ℃恒溫箱中放置20～30 min后鏡檢。每個制片隨機選取5個視野，記錄花粉總數和有活力花粉的數目，取其平均值，計算花粉活力。

花藥相對含水量測定：采用烘干法。將離心管在120 ℃的烘箱中烘至恒重w1，然后放入適量（0.1～0.2 g）花粉，稱重得數據w2，每隔1 h分別取樣放入120 ℃烘箱中烘至恒重，取出放入干燥皿內冷卻后稱重，記下讀數w3。花藥相對含水量y=（w2-w3）/（w2-w1）×100%，2次重復。

1.2.2 花粉的超低溫保存及化凍處理 將新鮮花粉或經干燥處理的花粉裝入凍存管，投入液氮（-196 ℃）進行貯藏，24 h后取出花粉，分別采用自來水沖洗化凍、室溫化凍、37 ℃水浴化凍，待恢復至室溫后進行測定，記錄保存前后花粉的活力，計算花粉活力相對保持率。花粉活力相對保持率=保存后花粉活力/保存前花粉活力×100%。

1.3 試驗數據的處理與分析

采用SPSS 19.0統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗，用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 花粉活力測定方法的篩選與確定

花粉活力代表了花粉的生活能力，有活力的花粉可以用于雜交授粉，完成植物受精過程。新鮮的花粉粒是最富有生命力的，但在雜交育種實踐中，由于各種植物花粉的壽命長短不同和花期不一致，需要把花粉保存一段時間再用，或因需要從其他地方運來花粉。因此，授粉前快速測定花粉活力顯得十分有必要。

取新小黑麥3號的新鮮花粉，分別采用I2-KI、TTC染色法測定其花粉活力，染色結果（圖1）表明，利用I2-KI對小黑麥花粉進行染色，花粉呈現藍色和褐色2種顏色，且染色效果不隨時間的延長而發生變化。成熟的花粉粒呈球形，積累較多的淀粉，I2-KI溶液可將其染成藍色，而發育不良的花粉呈畸形，往往不含淀粉或積累淀粉較少，I2-KI溶液染色呈黃褐色，失活的花粉以及經過乙醇處理的花粉（對照）遇碘同樣呈藍色反應。因而I2-KI溶液染色法不能很好地區分有活力的花粉和已喪失活力的花粉。利用TTC染色，花粉細胞出現紅色、淡紅色和無色3種顏色反應，且隨時間的延長細胞的染色率逐漸下降。花粉經乙醇處理后（對照）失活，用TTC染色，不能著色。說明TTC染色法測定小黑麥花粉活力相對準確。本研究用1%TTC進行染色，結果發現新小黑麥3號的新鮮花粉染色率相對較低，為50%左右，分析認為是高濃度的TTC對花粉細胞有毒害作用。而用0.1%TTC和0.5%TTC染色后花粉著色率相對較高，分別為92.3%和79.1%。方差分析表明，不同濃度TTC染色液染色結果間存在極顯著（P<0.01）差異。因此，TTC溶液濃度為0.1%時較適合用來測定小黑麥花粉的活力。

2.2 花藥相對含水量的測定結果

由圖2可知，隨著干燥時間的延長，新小黑麥1號的花藥相對含水量逐漸降低，與室溫自然干燥相比，采用硅膠干燥法水分散失較快，干燥效果相對較好。正在散粉的小黑麥花藥的初始相對含水量平均為71.65%，干燥處理1～3 h內水分散失較快，3 h后室溫干燥花藥含水量達到45.8%，硅膠干燥花藥含水量達到34.5%，7 h后花藥相對含水量分別為18.5%、10.0%。對花藥相對含水量（y）和干燥時間（x）進行擬合，結果發現自然干燥和硅膠干燥的花藥相對含水量與干燥時間均呈極顯著（P<0.01）負指數關系，擬合方程分別為：y=91.71×EXP（-0.182x），r2=0.967 9；y=102.47×EXP（-0.293x），r2=0.992 9。

2.3 花藥相對含水量對小黑麥花粉超低溫保存效果的影響

分別將新小黑麥1號的新鮮花粉（P1）、硅膠干燥處理3 h（P2）和6 h（P3）的花粉投入液氮保存5、10 d后，取出在自來水下快速化凍測定其花粉活力，結果如表1所示。由表1可知，在超低溫保存下，隨著時間延長不同處理的花粉活力變化趨勢明顯不同。經過硅膠干燥處理3 h的花粉放入液氮經超低溫冷凍保存后，其活力基本呈現穩定趨勢，最終活力穩定在78.0%，保存前后花粉活力相對保持率為92.3%。這是由于干燥處理后的花粉相對含水量低，在超低溫保存及化凍過程中不易產生冰晶，花粉活力基本保持不變。新鮮花粉在超低溫保存前后的活力變化很大，保存5 d和10 d后花粉活力分別由99.8%降低至44.5%和28.6%，這是由于新鮮花粉含水量高，在結凍與化凍的過程中容易產生冰晶使細胞膜受損。經硅膠干燥處理6 h的花粉在投入液氮前活力已經很低，不適合保存，這是由于小黑麥的花粉是三核型花粉，不耐干燥，延長干燥時間會導致小黑麥花粉活力降低，經過超低溫保存后活力很低，最終花粉活力保持率為36.1%。顯著性檢驗結果（表1）表明，經硅膠干燥處理3 h的花粉在超低溫保存前后，其花粉活力差異不顯著（P>0.05）。因此，硅膠干燥3 h的花粉比較適合小黑麥花粉的超低溫保存。液氮超低溫冷凍保存是相對較為理想的保存方式，相對干燥的小黑麥花粉的活力隨著時間的延長不會出現明顯的下降趨勢，理論上可以長時間保存。

2.4 化凍方法對小黑麥花粉超低溫保存效果的影響

分別取新小黑麥1號、新小黑麥3號、新小黑麥4號和新小黑麥5號的花粉在硅膠中干燥處理3 h后進行超低溫冷凍保存，保存5 d后取出，分別采用室溫（23 ℃）、37 ℃水浴和自來水沖洗化凍3種方法進行化凍處理，30 min后測定其花粉活力，結果如圖3所示。由圖3可知，新小黑麥1號、新小黑麥3號、新小黑麥4號和新小黑麥5號的花粉在液氮保存5 d后，采用自來水沖洗化凍，其最終的花粉活力最高，37 ℃水浴化凍的活力次之，室溫下自然化凍的花粉活力最低。顯著性檢驗表明，新小黑麥1號和新小黑麥3號在37 ℃水浴化凍和自來水沖洗化凍下花粉活力差異不顯著（P>0.05），但二者顯著（P<0.05）高于室溫化凍時的活力；而新小黑麥4號和新小黑麥5號在不同化凍方式下均存在顯著差異（P<0.05），以自來水沖洗化凍方式花粉活力最高。因此，用自來水沖洗化凍是簡便適合的化凍方式。

3 結論與討論

3.1 花粉活力測定方法的篩選與確定

多數植物正常的成熟花粉粒呈球形，積累較多的淀粉，I2-KI溶液可將其染成藍色；而發育不良的花粉往往不含淀粉或積累淀粉較少，染色呈黃褐色，而已喪失活力的花粉和經過乙醇處理的花粉（對照）因為細胞內存在有淀粉，遇碘同樣呈藍色反應。因而I2-KI溶液染色不能很好地區分有活力的花粉和無活力的花粉，不適用于對小黑麥花粉活力的測定。

TTC是呼吸鏈系統的質子受體，與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，凡被染為紅色的花粉活力強，淡紅色次之，無色的為沒有活力或不育花粉，因此花粉細胞出現紅色、淡紅色和無色3種顏色反應。對照花粉經乙醇處理后失活，用TTC染色不能著色，說明TTC染色結果能很好地區分有活力的花粉和無活力的花粉，適合小黑麥花粉活力的測定。另外，高濃度的TTC對花粉細胞的毒性作用會導致某些有活力的花粉隨著時間的延長逐漸褪色，使試驗結果偏低。本研究將TTC溶液濃度降低到0.1%，染色效果較好。

3.2 花藥相對含水量和貯藏溫度對花粉活力的影響

新鮮花藥的含水量較高，其活力和萌發力較高。花藥含水量越高，進行低溫貯藏時越容易形成冰晶，使細胞膜受損，花粉死亡率就越高，達不到貯藏的目的。所以為了避免冷凍時細胞內結冰，提高花粉存活率，在冷凍保存之前必須對花粉進行干燥脫水處理。進行花粉干燥既要把含水量降低，控制在一定范圍之內，又要保證花粉保持較高活力和萌發力。本試驗結果表明，小黑麥的花藥相對含水量在30%左右時是放入液氮內保存的最佳時期。

本研究結果認為，超低溫和干燥處理是花粉活力得以延長的必要條件，這與前人的結果一致[12-14]。超低溫降低了花粉內部呼吸強度，而花粉保存前的干燥處理抑制了花粉代謝，降低了酶的活力，避免了花粉冷凍和化凍過程中的傷害，從而使花粉壽命得以延長。

3.3 化凍方法對小黑麥花粉活力的影響

花粉的化凍方式一般有自然化凍、室溫化凍、自來水沖洗化凍等幾種方式。許多研究認為，液氮保存對植物的傷害是在冰凍和化凍兩個過程中發生的，因此要使植物花粉的超低溫保存獲得成功，選擇合適的化凍方法是最重要的。較好的化凍方式既能避免在化凍過程中產生花粉細胞內的再次結冰，又能防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的破壞。研究結果表明，超低溫保存材料在化凍時再次結冰的危險溫度區大約是-5～10 ℃[14]，所以化凍一般在35～40 ℃溫水中進行，借助迅速的化凍速度通過此溫度區，避免細胞內次生結冰對細胞的致死性破壞。王彩紅等[15]采用0、16、37 ℃ 3種溫度進行化凍，研究顯示含水量為7.3%的材料采用任何一種化凍溫度都獲得良好效果，花粉含水量較高時采用37 ℃溫水化凍較好。本試驗采用37 ℃水浴、自來水沖洗、自然化凍3種方法，試驗結果表明，自來水沖洗是簡便易行且較適合的化凍方式。

干燥法超低溫保存是貯藏小黑麥花粉的相對較為理想的保存方式，然而關于超低溫保存前后花粉生理生化變化和遺傳性狀穩定性等機理仍有待于進一步研究。

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