生物炭對烤煙質(zhì)體色素代謝的影響

楊永霞,張嘉煒,王 晶,馮小虎,崔 紅*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,鄭州市農(nóng)業(yè)路63號 450002

2.江西省煙草公司撫州市公司,江西省撫州市大公路115號 344000

生物炭對烤煙質(zhì)體色素代謝的影響

楊永霞1,張嘉煒1,王 晶1,馮小虎2,崔 紅*1

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,鄭州市農(nóng)業(yè)路63號 450002

2.江西省煙草公司撫州市公司,江西省撫州市大公路115號 344000

為揭示生物炭對烤煙質(zhì)體色素代謝的影響機理,以烤煙品種K326為材料,從細胞組織結(jié)構(gòu)、基因表達以及物質(zhì)代謝三個層面進行了研究.細胞超微結(jié)構(gòu)分析表明:中部葉成熟早期,添加300和600 kg/hm2生物炭煙葉類囊體片層數(shù)量較多,隨著葉片成熟類囊體片層數(shù)量減少,不施用生物炭的對照煙葉類囊體片層數(shù)量減少更明顯.基因表達分析顯示:打頂后色素合成相關(guān)基因的表達逐漸減弱,色素降解相關(guān)基因的表達增強;添加300和600 kg/hm2生物炭,煙葉類胡蘿卜素合成及降解相關(guān)基因表達相對較強.物質(zhì)代謝分析表明:打頂后煙葉色素含量(質(zhì)量分數(shù))逐漸降低;添加生物炭后色素積累較多.中部葉成熟后期,添加300 kg/hm2生物炭的處理煙葉色素積累最多,隨生物炭施用量的增加,煙葉色素積累減少并接近對照.添加300 kg/hm2生物炭的處理調(diào)制后煙葉色素降解產(chǎn)物及中性致香物質(zhì)總量最高,而不施用生物炭的處理最低.因此,施用適量生物炭有利于成熟期煙葉色素的代謝及調(diào)制后煙葉中性致香物質(zhì)的形成.

烤煙;生物炭;質(zhì)體色素;物質(zhì)代謝;細胞結(jié)構(gòu);基因表達

煙草質(zhì)體色素是多種中性致香物質(zhì)的前體物,與烤煙品質(zhì)和香氣風(fēng)格密切相關(guān)[1].類胡蘿卜素作為光輔助色素,不僅可以防止光氧化[2],其降解產(chǎn)生的香味物質(zhì)也可直接影響煙葉品質(zhì)和風(fēng)格[3-4].煙草質(zhì)體色素的合成與降解受多種因素影響,如品種、生態(tài)環(huán)境和栽培管理措施等[5-7].生物炭是利用特定的炭化技術(shù),以自然界中廣泛存在的生物質(zhì)資源(如木材、家禽糞便和秸稈等)為材料,在lt;700℃的溫度和無氧或限氧條件下熱解而得到的一種細粒度、多孔性的碳質(zhì)材料[8],其綜合效應(yīng)良好[9].有研究表明,土壤添加生物炭能夠改變作物根系形態(tài),提高根系生理活性和酸性土壤的pH,進而增強土壤肥力,維持植株適宜的根冠比,提高作物產(chǎn)量[10-11].此外,土壤添加生物炭還會影響土壤微生物群落組成以及氮循環(huán)尤其是銷態(tài)氮的吸附、排放和轉(zhuǎn)化,并減輕重金屬積累[12-13].目前,在煙草上的研究主要集中在施用生物炭對植煙土壤理化性質(zhì)及煙株經(jīng)濟性狀的影響方面[14-15],而對煙葉細胞超微結(jié)構(gòu)和物質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響則研究較少.為此,對植煙土壤施用不同量的生物炭,從煙葉細胞組織結(jié)構(gòu)、基因表達以及物質(zhì)代謝三方面進行系統(tǒng)研究,旨在為優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗于2013年在江西省撫州市廣昌縣長橋鎮(zhèn)進行.供試煙草品種K326,試驗地土壤為水田砂壤土,其基本理化性狀:有機質(zhì)25.8 g/kg、堿解氮210 mg/kg、速效磷 10 mg/kg、速效鉀 76 mg/kg、pH5.2.按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉栽培技術(shù)規(guī)范進行管理,選取中部12葉位(從葉片發(fā)生2 cm時即為葉齡第1天)進行掛牌標(biāo)記.添加的生物炭以花生殼、玉米秸稈為原材料,經(jīng)過機械粉碎后裝入程序控溫馬弗爐(KSW-4D-11,上海躍進醫(yī)療器械廠)中,在550℃的限氧熱解狀態(tài)下連續(xù)炭化3～4 h,冷卻后粉碎,過75μm(200目)篩,即得所需的生物炭.試驗設(shè)置4個處理:①常規(guī)施肥(CK);②在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上增施生物炭300 kg.hm-2(T1);③在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上增施生物炭600 kg.hm-2(T2);④在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上增施生物炭900 kg.hm-2(T3).

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片超微結(jié)構(gòu)的觀察

參照文獻[16]的方法在打頂后10、20、30和40 d時,用鋒利刀片切取從葉尖向葉基數(shù)第6～8條支脈間1 mmX2 mm的葉片,迅速置于4%的戊二醛溶液中,抽真空固定并于4℃條件下保存,在透射電鏡下觀察并拍照.

1.2.2 質(zhì)體色素基因表達分析

在打頂后10、20、30和40 d,選取生長發(fā)育良好的不同煙株的3片中部葉,于液氮中冷凍,后置于-80℃冰箱保存.采用Trizol法進行煙葉總RNA的提取,用隨機引物法合成cDNA.利用Primer Premier5軟件設(shè)計煙草質(zhì)體色素基因擴增引物,L25為內(nèi)參基因(表1),采用半定量RT-PCR進行基因表達差異分析.PCR反應(yīng)體系為20 μL,PCR擴增程序為:94℃5 min;94℃30 s,50℃(退火溫度根據(jù)引物不同而變化)30 s,72℃1 min,共35個循環(huán);72℃10 min.采用1.0%瓊脂糖凝膠進行PCR產(chǎn)物檢測.

表1 引物序列

1.2.3 質(zhì)體色素含量及相關(guān)降解產(chǎn)物的測定

打頂后質(zhì)體色素取樣時期和方法同1.2.2節(jié)基因表達分析.每個樣品3次重復(fù),凍干后備用.烤后煙葉按照國標(biāo)分級[17],取C3F樣品,分別用于質(zhì)體色素及降解產(chǎn)物含量(質(zhì)量分數(shù))的測定.所有樣品粉碎后過380μm(40目)篩.參照文獻[16]進行煙株大田生長期及烤后煙葉質(zhì)體色素含量(質(zhì)量分數(shù))的測定,參照文獻[18]進行烤后煙葉質(zhì)體色素降解產(chǎn)物含量(質(zhì)量分數(shù))的測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化

電鏡觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)(圖1)顯示,土壤添加不同量生物炭的處理煙葉細胞組織結(jié)構(gòu)變化規(guī)律基本一致.在中部葉成熟前期,淀粉粒體積變化較小,嗜鋨顆粒較為豐富,類囊體片層數(shù)量較多;處理間比較,以T1和T2處理的煙葉細胞類囊體片層數(shù)量較多.隨著葉片的成熟,葉綠體被膜上的嗜鋨物質(zhì)明顯減少、類囊體片層消失,細胞表現(xiàn)出衰老的特征.不施生物炭的CK煙葉細胞衰老特征更為明顯,生物炭施用量越多,類囊體片層數(shù)量減少越慢,細胞衰老越緩慢.

圖1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)

2.2 色素代謝途徑關(guān)鍵基因的表達

圖2 不同用量生物炭處理煙葉色素代謝相關(guān)基因表達差異的比較

如圖2所示,打頂后隨著葉片的成熟,各處理煙葉中與葉綠素和類胡蘿卜素合成有關(guān)的鎂離子螯合酶基因(Mg-chelatase,CHL,合成葉綠素鎂分支的第一個關(guān)鍵酶)、八氫番茄紅素合成酶基因(phytoene synthase,PSY,催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸向八氫番茄紅素的轉(zhuǎn)化)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因(ζ-carotene desaturase,ZDS,催化ζ-胡蘿卜素向番茄紅素的轉(zhuǎn)化)和番茄紅素-β-環(huán)化酶基因(lycopene-β-cyclase,LCYb,催化番茄紅素轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素)表達逐漸減弱,與降解相關(guān)的葉綠素酶基因(chlorophyllase,CLH,葉綠素分解代謝過程中的限速酶)、脫鎂葉綠酸a加氧酶基因(pheophorbide a monooxygenase,PAO,催化葉綠素卟啉環(huán)開環(huán)生成四元線性吡咯衍生物的關(guān)鍵酶)和類胡蘿卜素裂解雙氧合酶基因(carotenoid cleavage dioxygenases,CCD1,降解類胡蘿卜素的關(guān)鍵酶)的表達量維持較高水平.不同處理相比,隨著生物炭施用量的增加,煙葉葉綠素和類胡蘿卜素合成相關(guān)基因CHL、PSY、ZDS和LCYb的表達呈減弱趨勢,而與降解相關(guān)基因的表達較強.綜合來看,T1和T2處理中,類胡蘿卜素合成及降解相關(guān)基因的表達整體較強.這說明施用生物炭,有利于煙葉質(zhì)體色素尤其是類胡蘿卜素的合成和降解,其中每公頃添加300和600 kg生物炭的處理效果較好.

2.3 質(zhì)體色素含量分析

由圖3可知,隨著葉片的成熟,各處理煙葉葉綠素(葉綠素a和葉綠素b),以及類胡蘿卜素(紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)、葉黃素和β-胡蘿卜素)含量變化趨勢相同,隨著生育期的推進,各處理烤煙質(zhì)體色素含量均呈下降趨勢.在煙葉成熟后期,添加生物炭處理的質(zhì)體色素含量均高于對照.其中,添加300 kg.hm-2生物炭的處理T1煙葉色素含量下降平緩,葉綠素和類胡蘿卜素色素積累最多.結(jié)合對葉綠體超微結(jié)構(gòu)及打頂后色素代謝關(guān)鍵基因的分析結(jié)果,說明施用生物炭能不同程度地延緩葉片的衰老,葉綠素和類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的表達相對更強,在成熟中后期煙葉葉綠素和類胡蘿卜素積累較多,煙葉成熟期延長.

圖3 不同用量生物炭處理煙葉質(zhì)體色素含量的變化

2.4 烤后煙葉質(zhì)體色素及相關(guān)降解產(chǎn)物含量

由圖4可知,調(diào)制后煙葉,中性致香物質(zhì)總量以及葉綠素降解產(chǎn)物新植二烯和類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物總量均為T1處理煙葉最高,對照最低.說明土壤中適當(dāng)添加生物炭有利于烤后煙葉中性致香物質(zhì)的形成.

圖4 不同用量生物炭處理煙葉質(zhì)體色素降解產(chǎn)物的變化

3 結(jié)論

對土壤中添加生物炭處理的煙葉細胞組織結(jié)構(gòu)、基因表達以及物質(zhì)代謝分析表明:①在中部葉成熟早期,添加300和600 kg.hm-2生物炭處理的煙葉細胞類囊體片層數(shù)量較多,隨著煙葉成熟,不施用生物炭的處理類囊體片層數(shù)量減少較多;②隨著生物炭施用量的增加,色素合成相關(guān)基因的表達減弱,降解相關(guān)基因的表達增強.添加300和600 kg.hm-2生物炭處理中,類胡蘿卜素合成及降解相關(guān)基因表達相對較強;③打頂后煙葉色素含量逐漸降低.土壤添加生物炭處理后,煙葉色素積累較多.成熟后期,添加生物炭量高的處理,煙葉色素積累量越低.調(diào)制后添加300 kg.hm-2處理的煙葉色素降解產(chǎn)物及中性致香物質(zhì)總量最高,而未添加生物炭的煙葉色素降解產(chǎn)物及中性致香物質(zhì)總量最低.說明土壤中添加生物炭有利于成熟期煙葉色素的積累和調(diào)制后煙葉中性致香物質(zhì)的形成.

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責(zé)任編輯 董志堅

Effects of Biochar on Plastid Pigment Metabolism in Flue-cured Tobacco

YANG Yongxia1,ZHANG Jiawei1,WANG Jing1,FENG Xiaohu2,and CUI Hong*1
1.Tobacco College,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China
2.Fuzhou Tobacco Company of Jiangxi Province,Fuzhou 344000,Jiangxi,China

To reveal the influence mechanism of biochar on the plastid pigment metabolism in flue-cured tobacco,the cell structure,gene expression and substance metabolism of cv.K326 were studied.Cell ultrastructure analysis indicated that:at the early mature stage of middle leaves,the thylakoid lamellae content in leaves treated by biochar application rate of 300 or 600 kg/ha was higher and decreased along with the development of tobacco leaves,and it decreased more obviously in the leaves without biochar application(the control).Gene expression analysis showed that:the expression of genes related to plastid pigment synthesis reduced gradually,while the expression of genes related to plastid pigment degradation increased after topping;and the expression of genes related to carotenoid biosynthesis and degradation was relatively stronger by biochar treatement at the rate of 300 or 600 kg/ha.Substance metabolism analysis suggested that:the plastid pigment content in leaves reduced gradually after topping;biochar application increased the plastid pigment accumulation in leaves.At the later stage of middle leaf maturing,the plastid pigment accumulation reached the highest in leaves treated by biochar at the rate of 300 kg/ha,while it decreased and was close to that in the control with the increase of biochar application rate.The contents of pigment degradation products and neutral aroma components in cured leaves treated by biochar at the rate of 300 kg/ha were the highest,while those in leaves without applying biochar were the lowest.Therefore,applying biochar at an appropriate rate is beneficial to the pigment metabolism in leaves at mature stage and the formation of neutral aroma components in cured leaves.

Flue-cured tobacco;Biochar;Plastid pigment;Substance metabolism;Cell structure;Gene expression

S359.2

A

1002-0861(2015)10-0026-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151004

2015-04-17

2015-05-29

中國煙草總公司江西省公司科技項目quot;江西煙葉物質(zhì)代謝規(guī)律及調(diào)控研究quot;(201201003).

楊永霞(1980-),博士,講師,主要從事煙草生物技術(shù)研究.E-mail:yyx624@126.com;*

崔紅,E-mail:cuihonger_13@163.com

楊永霞,張嘉煒,王晶,等.生物炭對烤煙質(zhì)體色素代謝的影響[J].煙草科技,2015,48(10):26-30.YANG Yongxia,ZHANG Jiawei,WANG Jing,et al.Effects of biochar on plastid pigment metabolism in flue-cured tobacco[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):26-30.