側柏葉對煙草倉儲害蟲煙草甲和赤擬谷盜的毒殺作用

吳 彥,張文娟,李志華,鄭歷史,王萍娟,韋建玉,黃東業,田兆福,李小蘭,杜樹山*

1.廣西中煙工業有限責任公司技術中心,南寧市北湖南路28號 530001

2.北京師范大學中藥資源保護與利用北京市重點實驗室,北京市新街口外大街19號 100875

3.遼寧中醫藥大學,遼寧省大連市雙D港生命一路77號 116600

側柏葉對煙草倉儲害蟲煙草甲和赤擬谷盜的毒殺作用

吳 彥1,張文娟2,李志華1,鄭歷史3,王萍娟1,韋建玉1,黃東業1,田兆福1,李小蘭1,杜樹山*2

1.廣西中煙工業有限責任公司技術中心,南寧市北湖南路28號 530001

2.北京師范大學中藥資源保護與利用北京市重點實驗室,北京市新街口外大街19號 100875

3.遼寧中醫藥大學,遼寧省大連市雙D港生命一路77號 116600

為有效防治煙草倉儲害蟲,進行了新型植物防護劑的開發研究.通過熏蒸和觸殺試驗測試了側柏葉揮發油及單體成分活性,并通過GC/MS分析了側柏葉揮發油的化學成分.結果顯示:①GC/MS分析共鑒定出側柏葉揮發油成分34種,占總成分的93.28%,其主要成分為:α-蒎烯(15.08%)、雪松醇(12.63%)、3-蒈烯(9.68%)和石竹烯(9.02%).②通過生物活性篩選,側柏葉揮發油對煙草甲和赤擬谷盜觸殺的半數致死量分別為50.45和48.59μg/頭;對二者熏蒸活性的半數致死濃度為145.40和39.25 mg/L.③從側柏葉揮發油中得到3種活性成分:α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇.因此,側柏葉揮發油及其活性單體對煙草甲和赤擬谷盜均具有一定的觸殺和熏蒸活性.

煙草;倉儲害蟲;煙草甲;赤擬谷盜;側柏葉;揮發油;活性

側柏葉為柏科植物側柏[Platycaldus orientalis(L.)Franco]的干燥枝葉,主要成分為黃酮類化合物、鞣質和揮發油等[1-2],柏葉揮發油中富含多種具有殺蟲活性的化合物.目前關于側柏葉的研究主要集中在其揮發油化學成分分析以及側柏葉揮發油對人肺癌細胞[3]、細菌[4]及真菌[5]的抑制作用方面,而對害蟲的毒殺作用則鮮見報道.煙葉在貯藏過程中易遭到害蟲的侵害[6],其中煙草甲(Lasioderma serricorne Fabricius)為優勢種、赤擬谷盜(Tribolium castaneum Herbst)為僅次于優勢種的種類.據CORESTA估計,煙草甲蟲每年對貯存煙草造成的損失約為1%[7].我國在20世紀90年代曾對全國貯煙害蟲的為害程度進行了調查,每年因蟲害引起的煙葉質量損失率約為1.64%,其中煙草甲蟲為害引起的質量損失遠大于其他貯煙害蟲[8-9].在煙草倉儲常規的害蟲防治方面目前以磷化氫(磷化鋁)熏蒸最為普遍,但磷化氫(磷化鋁)的長期使用會對環境和人類健康造成一定影響[10-11].由此,2010年4月,美國環保署(EPA)發布了農藥中磷化鋁和磷化鎂熏蒸劑的使用限制[12].近年來植物源殺蟲劑的研究和開發受到一定重視,其中揮發性植物成分如植物精油是目前研究較多的一類植物殺蟲劑,具有高度選擇性,易于分解,對人畜安全性高等優點.且多數對天敵生物毒性小,對害蟲卻有引誘、忌避、拒食和生長調節等作用[13-14].根據柏科植物精油中富含的殺蟲活性物質及殺蟲特性,選擇資源豐富的側柏葉為靶標,對其揮發油及單體化合物進行殺蟲活性試驗,旨在開發出新型植物防護劑,有效防治煙倉害蟲.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

柏科植物側柏Platycladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉購于河北省安國藥材市場.側柏葉樣本(BNU-CMH-Dushushan-2012-09-10-010)保存于北京師范大學資源學院北京市重點實驗室,新鮮枝葉風干1周后備用.

正己烷、乙醚、無水硫酸鈉等均為分析純(北京北化精細化學品有限責任公司).

Thermo Finngen TRACE DSQ氣-質聯用儀,質譜檢索NIST譜庫,GHP-9160隔水式恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司);移液槍(量程范圍0.1～2.5μL、0.5～10μL和10～100μL,大龍創興實驗儀器有限公司);Bruker Avance DRX 500核磁共振譜儀(美國布魯克公司).

1.2 方法

1.2.1 樣品處理與分析

取側柏葉8 kg粉碎后,用揮發油提取器進行提取,時間為6 h,油水經正己烷溶劑萃取,無水硫酸鈉處理后過濾,常壓濃縮至不含溶劑,得到無色揮發油13.4 mL并于4℃冰箱保存,側柏葉出油率為0.17%.

1.2.2 化合物的分離

側柏葉揮發油10 mL,經正相硅膠柱層析,采用正己烷、正己烷-乙酸乙酯、乙酸乙酯依次梯度洗脫分段,獲得25個餾分段,再經石油醚-丙酮(100∶1,體積比)反復硅膠柱層析分離,最終分別從餾分段3、8和16中獲得3種單體化合物.

1.2.3 生物活性的篩選

1.2.3.1 熏蒸活性的測定

參照文獻[14]的方法測定揮發油及單體化合物對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性.將10頭供試昆蟲(試蟲)放入直徑2.5 cm,高5.5 cm的玻璃瓶中,然后用移液槍吸取10μL樣品的正己烷稀釋液(預實驗濃度為50%、10%和2%;根據預實驗結果設置5個濃度梯度)滴于置瓶蓋內直徑20 mm的濾紙片上,另取正己烷為空白對照,磷化氫和甲基溴分別作為煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性陽性對照,揮發20 s后,迅速擰緊瓶蓋密封,形成密閉空間,瓶口涂有聚四氟乙烯,防止試蟲接觸到含藥劑的濾紙.每處理重復5次,每重復10頭.處理后置于溫度(29±1)℃,相對濕度為70%～80%的恒溫培養箱中培養24 h,觀察記錄死亡情況,并計算死亡率與校正死亡率.采用SPSS17.0統計軟件分析計算半致死濃度LC50(mg/L).觀察死亡情況前先用力搖動玻璃瓶,再將玻璃瓶倒置,5 min后觀察,蟲體不動即為死亡.

死亡率=(死蟲數/試蟲數)X100%

校正死亡率=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)X100%

1.2.3.2 觸殺活性的測定

參照文獻[15]的方法測定揮發油及其單體化合物對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性.將羽化一周左右的成蟲從培養瓶中取出,先用乙醚麻醉,然后用移液槍取0.5μL樣品的正己烷稀釋液(濃度同1.2.3.1節)滴于試蟲的前胸背板上(置于冰袋上操作),處理后放入直徑2.5 cm,高5.5 cm玻璃瓶中,正己烷為空白對照組,除蟲菊素作為陽性對照組,各樣品設置5個濃度,每個濃度重復5次,每個重復試蟲10頭.處理組、空白對照組及陽性對照組培養溫濕度條件、時間和試蟲的死亡情況調查與計算同1.2.3.1節,計算半致死劑量LD50(μg/頭).

2 結果與分析

2.1 側柏葉揮發油的化學成分分析

GC/MS總離子流色譜見圖1,經計算機檢索NIST數據庫,比對各峰的MS碎片并結合有關文獻譜圖解析,鑒定出34種化合物,見表1.其中鑒定出的α-蒎烯含量最高,占揮發油成分的15.08%.

圖1 側柏葉揮發油GC/MS總離子流圖

表1 側柏葉揮發油化學成分及其相對含量

表1(續)

有研究表明,對于側柏葉,水蒸氣蒸餾法提取揮發性成分較完全[4].結合圖1和表1可知,側柏葉揮發油共鑒定出34種化學成分,占總揮發油的93.28%,提取較完全,其中主要成分為α-蒎烯、雪松醇、3-蒈烯、石竹烯和α-石竹烯,化合物類型以烯、醛、醇和酯等為主.

有文獻報道,山東濟南產側柏葉揮發油的成分主要為α-蒎烯(24.89%)、β-雪松烯(20.96%)和4-蒈烯(9.16%)[15].遼寧千山產側柏葉揮發油主要成分為β-雪松醇(31.43%)和2,6-二叔丁基對甲酚(17.46%)[16].新疆產側柏葉主要成分為α-側柏烯(17.20%)、α-蒎烯(8.42%)和檸檬烯(4.92%)[17].這與本實驗結果存在一定差異.說明同種植物品種由于產地(生態環境)、生長年限和采樣時間等不同導致其組成及含量的差異.

2.2 化合物分離

取側柏葉揮發油10 mL,經過反復硅膠柱層析分離,共得到3種單體化合物,經鑒定分別為α-蒎烯[18](0.98 g)、β-水芹烯[19](0.48 g)和4-萜烯醇[20](0.16 g).

2.3 生物活性

2.3.1 熏蒸活性

由表2可知,側柏葉揮發油對煙倉害蟲煙草甲和赤擬谷盜均有一定的熏蒸毒殺作用,LC50分別為145.40和39.25 mg/L.在分離的3種化合物中,4-萜烯醇對兩種煙倉害蟲的熏蒸毒性最好,且對煙草甲的熏蒸毒性是赤擬谷盜的2.88倍.然而,4-萜烯醇對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性均小于對照藥劑磷化氫和甲基溴.在熏蒸活性測試中,β-水芹烯對煙草甲和赤擬谷盜的毒性也較高.從側柏葉揮發油中得到的3種化合物中,α-蒎烯對兩種煙倉害蟲的熏蒸活性較弱,其對赤擬谷盜的毒性強于對煙草甲的毒性.側柏葉揮發油的主要成分α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇對兩種煙倉害蟲的活性均大于側柏葉揮發油的活性.

表2側柏葉揮發油及單體對煙草甲和赤擬谷盜的毒性

2.3.2 觸殺活性

與熏蒸活性相比,側柏葉揮發油的3種單體化合物的觸殺活性均較弱,且均低于相同實驗條件下的對照(除蟲菊素)對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性.側柏葉揮發油的3種單體化合物中觸殺活性最好的是4-萜烯醇,4-萜烯醇對煙草甲和赤擬谷盜觸殺的LD50分別為5.42和19.67 mg/L.α-蒎烯對赤擬谷盜的觸殺活性是煙草甲的2.9倍.而β-水芹烯對煙草甲的觸殺活性高于赤擬谷盜,是赤擬谷盜觸殺活性的1.34倍.除了α-蒎烯對煙草甲的觸殺活性較弱外,β-水芹烯、4-萜烯醇對兩種煙倉害蟲的觸殺活性均大于側柏葉揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性.

3 小結與討論

通過GC/MS分析及生物活性篩選發現:①側柏葉揮發油成分主要是單萜和倍半萜;②側柏葉揮發油及其3種主成分α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇對煙倉害蟲煙草甲和赤擬谷盜均有一定的毒性.因此,將側柏葉揮發油及其活性成分開發為新型植物型熏蒸劑或防護劑并應用于煙草倉儲害蟲防治具有重要意義.

本試驗中測定了側柏葉揮發油的殺蟲活性,發現側柏葉揮發油及其部分單體化合物對煙倉害蟲煙草甲和赤擬谷盜均具有一定的熏蒸和觸殺毒性.雖然作用效果低于陽性對照,但作為植物防護劑,具有對有害生物高效、對非靶標生物安全、易分解、分解產物對環境無損害的特點[7,11,13],在倉儲害蟲防治過程中已成為較理想的化學農藥替代品之一.然而,目前有關側柏葉揮發油對煙倉害蟲的驅避作用,對成蟲產卵行為的干擾作用、拒食作用以及對害蟲種群的抑制作用方面還需進一步深入研究,對煙倉害蟲的作用機理仍需要進一步試驗.

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責任編輯 董志堅

Toxic Activities ofPlatycladus orientalisAgainstLasioderma serricorneand Tribolium castaneumin Stored Tobacco

WU Yan1,ZHANG Wenjuan2,LI Zhihua1,ZHENG Lishi3,WANG Pingjuan1,WEI Jianyu1,HUANG Dongye1,TIAN Zhaofu1,LI Xiaolan1,and DU Shushan*2

1.Technology Center,China Tobacco Guangxi Industrial Co.,Ltd.,Nanning 530001,China
2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese MedicineProtection and Utilization,Beijing Normal University,Beijing 100875,China
3.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,Liaoning,China

In order to effectively control the pests in stored tobacco leaves,new botanical protectants were studied and developed.The activities of essential oil and isolated components of Platycladus orientalis were tested via fumigation and contact toxicity assays,and the chemical components in the essential oil were analyzed by GC/MS.The results showed that:1)A total of 34 components were identified in the essential oil,which accounted for 93.28%of total components;and the major components were α-pinene(15.08%),cedrol(12.63%),3-carene(9.68%)and caryophyllene(9.02%).2)By means of bioactivity screening,the essential oil possessed potential contact toxicity against Lasioderma serricorne(LD50=50.45 μg/adult)and Tribolium castaneum(LD50=48.59 μg/adult), and it also possessed fumigation toxicity against Lasioderma serricorne(LC50=145.40 mg/L)and Tribolium castaneum(LC50=39.25 mg/L).3)Three active components,α-pinene,β-phellandrene and 4-terpinenol,were obtained from the essential oil.It was proved that the essential oil of Platycladus orientalis and its active isolated components possessed certain contact and fumigation toxic activities against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum.

Tobacco;Pest in stored tobacco;Lasioderma serricorne;Tribolium castaneum;Platycladus orientalis;Essential oil;Activity

S43

A

1002-0861(2015)10-0031-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151005

2014-09-19

2015-07-10

北京市自然科學資金資助項目quot;竹葉花椒防治藥材倉儲害蟲活性物質基礎及作用機理研究quot;(7142093).

吳彥(1972-),博士,副研究員,主要從事天然植物在卷煙減害增香中的應用研究及藥理學研究.E-mail:abelabel@126.com;*

杜樹山,E-mail:dushushan@bnu.edu.cn

吳彥,張文娟,李志華,等.側柏葉對煙草倉儲害蟲煙草甲和赤擬谷盜的毒殺作用[J].煙草科技,2015,48(10):31-35,56.WU Yan,ZHANG Wenjuan,LI Zhihua,et al.Toxic activities of Platycladus orientalis against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum in stored tobacco[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):31-35,56.