檳榔堿的腎毒性實驗研究

曾 薇，古桂花，李建新，尹為華，袁勁松*

（北京大學深圳醫院，深圳518036）

檳榔是棕櫚科（Palmae）植物檳榔Areca catechu L.的干燥成熟種子，作為一種全世界廣泛使用的嗜好品，其消費量僅次于煙草、酒精和咖啡因。 嚼食檳榔能使人產生輕微的欣快感和興奮性，長期嚼食還有一定的成癮性和毒性， 早在1988年KK Wary 就發現，體外實驗中檳榔粗提物在100 μg/mL可提高小鼠腎細胞的分裂速率，250 μg/mL 時便可誘導腎細胞DNA 斷裂[1]。 另有文獻報道，長期咀嚼檳榔的人比不咀嚼檳榔的人患慢性腎臟疾病的可能性更大[2]，他們的收縮壓、血清尿素氮、肌酐以及尿酸的水平顯著高于正常人[3-4]。 檳榔中的生物堿是主要毒性成分，其中含量最高的是檳榔堿。本課題組前期研究發現檳榔粗提物及檳榔堿存在肝毒性[5]，并發現其對腎功能也有一定的影響，本研究比較了不同濃度的檳榔堿對小鼠腎功能以及細胞損傷的影響。

1 材料

1.1 試驗藥物

氫溴酸檳榔堿對照品采購于中國藥品生物制品檢定所，純度99.5%，批號：111684-200401，分別加生理鹽水配制成0.25、0.5、1.0 mg/mL 的低、中、高劑量組備用。

1.2 動物

SPF 級昆明種小鼠，40 只， 雌雄各半， 體質量23～25 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供（動物合格證編號：0094066）。 在溫度（22±2）℃，通風良好的屏障級環境中適應性喂養5 d。

1.3 試劑

Cr 測定試劑盒、BUN 測定試劑盒（美國BECKMAN COULTER 公司）。

1.4 儀器

BP211D 電子天平 （德國SARTORIUS 公司）；5810R 低溫離心機（德國EPPENDORF 公司）；AU5421全自動生化分析儀 （美國BECKMAN COULTER 公司）；DM4000B 正立顯微鏡（德國LEICA 公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

將40 只小鼠隨機分為4 組，雌雄各半，每組10只。 A 為正常對照組，生理鹽水灌胃20 mL/(kg·d)；B、C、D 分別為檳榔堿低、中、高劑量組，給藥劑量分別為5、10、20 mg/(kg·d)。 每天稱體質量，并根據體質量調整用藥劑量，連續給藥28 d。

2.2 腎臟血清功能指標的測定

小鼠股動脈取血約1 mL， 待血液自然凝固后2 000 r/min 離心5 min 分離得血清， 使用全自動生化分析儀檢測各組血清中血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）以及尿素氮/肌酐比值（BUN/Cr）含量的變化。

2.3 腎臟形態及重量系數的比較

乙醚麻醉小鼠，解剖取其腎臟，觀察腎臟大小、質量、外型、硬度的變化，記錄單側腎臟質量，計算單側腎臟質量系數：

腎臟質量系數=單側腎濕質量/體質量×100%

2.4 腎臟病理組織學觀察

解剖小鼠摘取腎臟， 取同側腎臟相同部位，以10%中性福爾馬林固定液固定， 常規石蠟包埋，切片， 片厚約4 μm，HE 染色， 制作腎臟病理組織切片，光鏡下作腎臟組織病理學觀察。

2.5 統計學分析

利用SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，所有計量資料以“±s”表示，單因素方差分析，組間進行兩兩比較。

3 結果

3.1 每周給藥劑量與體質量的變化

記錄每天給藥之前的體質量，平均選取每周的第1 天進行數據統計，結果見表1。 發現在任一時間段內給藥組與正常組比較，體質量差異無統計學意義。

表1 給藥過程中各組小鼠的體質量變化比較 （±s，n=10，g）

表1 給藥過程中各組小鼠的體質量變化比較 （±s，n=10，g）

組 別正常對照組檳榔堿低劑量組檳榔堿中劑量組檳榔堿高劑量組給藥劑量（mg/kg）— 5 1 0 20 1 d 24.03±1.37 23.90±1.48 24.21±1.91 24.55±1.29 8 d 26.54±2.90 26.63±2.55 27.65±2.91 27.04±3.36a 15 d 28.61±4.39 29.00±3.27 30.50±4.82 28.52±3.87 22 d 29.25±3.54 32.86±3.18 32.55±5.55 32.23±4.65 29 d 31.27±3.86 33.57±4.26 33.06±3.11 33.08±4.87

3.2 血清腎功能生化指標的變化

與正常對照組比較， 實驗組的Cr、BUN 均有顯著性升高（P＜0.01），升高程度呈現劑量依賴性，說明檳榔堿會對小鼠的腎功能產生影響。BUN/Cr 比值在檳榔堿高劑量組中有顯著升高，說明高劑量的檳榔堿有可能對腎臟產生不利影響。 結果見表2。

表2 不同劑量的檳榔堿對小鼠腎功能生化指標的影響（±s，n=10）

表2 不同劑量的檳榔堿對小鼠腎功能生化指標的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較**P＜0.01。

組 別正常對照組檳榔堿（低）檳榔堿（中）檳榔堿（高）Cr(μmol/L)25.9±0.67 28.4±1.04**30.58±1.30**31.93±1.16**給藥劑量（mg/kg）— 5 1 0 20 BUN(mmol/L)6.77±0.20 7.80±0.35**8.29±0.30**9.34±0.32**BUN/Cr 0.26±0.01 0.28±0.02 0.28±0.02 0.29±0.02**

3.3 腎臟形態及質量系數的變化

將腎臟取出后肉眼觀察，正常對照組與給藥組的腎臟肉眼觀察沒有明顯的差異。 對腎臟系數數據進行組內及組間差異顯著性分析， 結果P＞0.05，說明在此實驗條件下，檳榔堿對小鼠腎臟的相對質量影響差異無統計學意義。 結果見表3。

表3 不同劑量的檳榔堿對小鼠腎臟系數的影響（±s，n=10）

表3 不同劑量的檳榔堿對小鼠腎臟系數的影響（±s，n=10）

給藥劑量（mg/kg）— 5 1 0 20體質量（g）31.27±3.86 33.57±4.26 33.06±3.11 33.08±4.87左腎重（g）0.196±0.015 0.210±0.032 0.208±0.025 0.196±0.035腎臟系數（%）0.630±0.046 0.620±0.025 0.630±0.035 0.590±0.027組 別正常對照組檳榔堿（低）檳榔堿（中）檳榔堿（高）

3.4 腎臟病理組織學變化

光鏡下正常小鼠腎臟的腎小球、 近曲小管、遠曲小管、出球微動脈及入球小動脈結構清晰，髓質內集合小管排列規則。 檳榔堿低劑量組小鼠腎小球旁可見局部血管擴張， 充血伴有出血及血栓形成，部分腎小球呈退變萎縮性改變，腎髓質內集合管間可見較多小血管擴張充血伴有少量小淋巴細胞浸潤。 檳榔堿中劑量組小鼠腎臟在局部可見少量腎小球呈退變萎縮性改變， 部分腎小球旁可見擴張、充血的小血管，腎髓質內集合管間可見部分小血管呈充血改變，可見少量散在的小淋巴細胞浸潤。 檳榔堿高劑量組小鼠腎臟部分區域可見退變萎縮的腎小球，局部腎小球旁可見有出血，周邊腎小管結構破壞；腎皮質內局部出血，腎小管結構破壞，可見脫落散在的腎小管上皮； 腎髓質內集合管間可見出血，出血區可見有少量炎細胞（見封三彩圖圖1）。

4 討論

本研究從生化檢驗學和組織病理形態學兩個角度探討了不同劑量檳榔堿對小鼠腎臟毒性的影響。 結果表明，與正常對照組相比，檳榔堿各劑量組小鼠血清Cr 和BUN 水平均有顯著升高。Cr 和BUN是反映腎損傷的指標，當兩者升高時，其與腎損傷程度呈正相關。血清Cr 的濃度變化主要由腎小球濾過率決定，濾過能力下降，則Cr 濃度升高，其高出正常值提示腎臟受損，因此血清Cr 能較準確地反映腎實質受損的情況。BUN 是蛋白質代謝產生的氨在肝臟經鳥氨酸循環生成的終產物， 經腎小球濾過，大部分隨尿排出，小部分被腎小管重吸收入血，由于腎臟代償功能強，60%～70%腎單位功能受損時，BUN 才高于正常。 另外BUN/Cr 比值升高也在一定程度上反映了腎小球濾過功能的損害程度。

暴露于檳榔堿的小鼠腎臟的質量系數沒有顯著性差異，可能是由于給藥時間不夠長，而檳榔對腎臟的損傷是一個慢性過程的結果。 而腎臟組織病理學結果提示， 檳榔堿對灌胃28 d 的小鼠腎臟存在一定的損害作用，說明咀嚼檳榔引起慢性腎臟疾病是一個漫長的過程，這也與文獻報道[1]相符，現階段的文獻對檳榔腎臟毒性的研究多屬于對長年咀嚼檳榔人群的流行病學研究。Hsu YH 等[6]回顧性考察了27 482 名志愿者連續7年的檳榔咀嚼史，對咀嚼檳榔與發生慢性腎臟病的關系做了多元線性回歸分析，認為二者存在相關性。 事實上，成人如果平均每天咀嚼50 顆檳榔， 那么引起機體代謝性堿中毒， 由腎臟消耗鉀引起低鉀血癥并導致腎機能不全的可能性更大[6]。 另外咀嚼檳榔比不咀嚼檳榔的人群患高蛋白尿的幾率更高， 這可能與檳榔堿具有中樞擬交感作用，具有使心率加快、頸總動脈和頸外動脈血流量增加的作用， 從而導致高蛋白尿有關[7]。 因此本實驗也是基于大量流行病學資料的基礎研究。

此外，課題組前期還做了檳榔粗提物及檳榔堿對小鼠的肝毒性研究，結果顯示檳榔堿會導致血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及堿性磷酸酶升高，并對小鼠的肝細胞有促凋亡作用[5]。 據文獻記載，氫溴酸檳榔堿對小鼠5 mg/kg 腹腔給藥14 d 即可破壞肝細胞的超微結構， 并抑制脾臟單核細胞的有絲分裂，20 mg/kg 便有明顯的促細胞凋亡現象[8]。 中醫認為肝腎同源，其生理病理密切相關，本實驗是基于檳榔對小鼠肝毒性的后續研究，結果表明檳榔能造成小鼠腎臟毒性，但較肝臟毒性輕微，這對于臨床上治療具有咀嚼檳榔飲食習慣的腎性疾病患者具有一定的指導作用， 但其致毒機制有待進一步研究。

[1]Wary KK，Sharan RN. Aqueous extract of betel-nut of northeast India induces DNA-strand breaks and enhances rate of cell proliferation in vitro. Effects of betel-nut extract in vitro [J]. J Cancer Res Clin Oncol，1988，114(6)：579-582.

[2]Lin SH， Lin YF， Cheema-Dhadli S，et al. Hypercalcaemia and metabolic alkalosis with betel nut chewing：emphasis on its integrative pathophysiology [J]. Nephrol Dial Transplant，2002，17(5)：708-714.

[3]Kang IM，Chou CY，Tseng YH，et al. Association between betelnut chewing and chronic kidney disease in adults [J]. J Occup Environ Med，2007，49(7)：776-779.

[4]Chou CY，Cheng SY，Liu JH，et al. Association between betel-nut chewing and chronic kidney disease in men [J]. Public Health Nutr，2009，12(5)：723-727.

[5]古桂花，曾 薇，胡 紅，等. 檳榔粗提物及檳榔堿對小鼠肝細胞凋亡的影響[J]. 中藥藥理與臨床，2013，29(2)：56-59.

[6]Hsu YH，Liu WH，Chen W，et al. Association of betel nut chewing with chronic kidney disease：a retrospective 7-year study in Taiwan [J]. Nephrology (Carlton)，2011，16(8)：751-757.

[7]Lin SK，Chang YJ，Ryu SJ，et al. Cerebral hemodynamic responses to betel chewing：a Doppler study [J]. Clin Neuropharmacol，2002，25(5)：244-250.

[8]Dasgupta R，Saha I，Pal S，et al. Immunosuppression，hepatotoxicity and depression of antioxidant status by arecoline in albino mice [J]. Toxicology，2006，227(1-2)：94-104.