SVF細胞影響移植脂肪LPL表達的實驗研究

樊 奇 鄭丹寧 余力王 健李鵬飛

SVF細胞影響移植脂肪LPL表達的實驗研究

樊 奇 鄭丹寧 余力王 健李鵬飛

目的探討脂肪移植后脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）在SVF（Stromal vascular fraction）輔助移植脂肪組織中的表達模式。方法本實驗以新鮮分離的自體SVF細胞輔助移植的脂肪組織為實驗組，以脂肪組織與等量生理鹽水的混合物為對照組，隨機在裸鼠背部兩側注射建立動物模型，對兩組移植物進行脂周蛋白免疫組化染色分析、LPL免疫組化染色分析和LPL蛋白含量測定。結果LPL蛋白含量測定及LPL免疫組化染色分析顯示，隨著移植時間的延長，實驗組和對照組LPL表達逐漸下降，在第2周、第3周、第4周時，實驗組LPL表達明顯高于對照組。脂周蛋白免疫組化染色分析顯示，兩組脂肪移植后的存活細胞均逐漸減少，但第2周、第3周、第4周實驗組存活細胞數高于對照組。結論SVF促進脂肪組織表達LPL，表達差異在移植后的第2周開始出現，這可能與SVF提高脂肪組織存活率和ASCs（Adipose-derived stromal cells）成脂分化有關。

脂肪間充質干細胞脂肪移植脂蛋白脂肪酶脂周蛋白

自體脂肪移植行軟組織充填時，90%的體積構成為脂肪細胞內的三酰甘油，最終體積取決于成活的脂肪細胞數量和三酰甘油含量。既往研究更多的是針對提高脂肪細胞的存活數量[1-4]，對于提高三酰甘油含量（即生脂調控）缺乏針對性的措施。

本實驗根據標準方法提取脂肪基質血管組分（SVFs），與人體脂肪混合移植于裸鼠，以添加生理鹽水的脂肪組織移植為對照。通過比較脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）的表達差異，探索SVF對于LPL表達的作用，以及可能的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡雌性裸鼠8只（本院實驗動物中心提供），體質量15.6～21.6 g（平均18.8 g）。

L-DMEM培養基、胎牛血清（HyClone公司）；抗脂蛋白脂肪酶抗體（Abcam公司）；脂周蛋白抗體（LSBio公司）；山羊抗兔二抗、BCIP/NBT顯色試劑盒（武漢博士德生物公司）；0.2 μm PVDF膜（Millipore公司）；Marker、Ⅰ型膠原蛋白酶（Sigma公司）、5×loding-buffer（Takara公司）；EpiQuickTM全組蛋白抽提試劑盒（EpiQuick公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪組織的獲取

脂肪組織來源于一名健康成年女性，通過抽脂術獲取皮下脂肪。在超凈工作臺內將抽取后的混合物以生理鹽水洗滌3次，并靜置分層。用10 m L注射器吸取10 m L脂肪顆粒置于無菌的三角燒瓶中；加入10 m L 0.075%Ⅰ型膠原酶，搖勻后置于37℃恒溫搖床內50 min；后將混合物600 g，離心10 min，倒掉上層油脂及液體，用生理鹽水將沉淀物懸浮，再次600 g，離心10 min。用移液器將上層液體吸出，剩余沉淀物即為基質血管成分（SVF）。將獲得的SVF細胞與脂肪組織混合，得到10 mL富含SVF細胞的混合物。另外留取2 mL洗凈沉淀的脂肪組織作為移植前的樣品放置于液氮中備用。20 mL混合物600 r/min，離心10 min，取中間的脂肪層。將與上述SVF懸液等量的生理鹽水與自體脂肪顆?；旌系玫?0 m L注射脂肪，作為對照組。

1.2.2 脂肪移植模型的建立

2%戊巴比妥鈉50 mg/K g腹腔注射麻醉裸鼠，用注射器連接18號針頭將1 m L SVF混合自體脂肪顆粒（實驗組）與1 m L生理鹽水自體脂肪顆?；旌衔铮▽φ战M），按隨機化原則分別注射于8只裸鼠背部的左側或右側，并標記。

1.2.3 脂肪移植物存活的評價

分別在移植1周、2周、3周、4周后取材，大體觀察移植物的形態，有無感染、壞死等現象。部分脂肪用于Western Blot檢測，迅速保存于液氮中，部分置于4%多聚甲醛中固定，浸蠟、包埋、切片，用于HE染色與免疫組化。

1.2.4 LPL表達的W estern blot檢測

對所取得組織蛋白進行蛋白初定量。配置分離膠和濃縮膠。向泳道中注入蛋白樣本，然后電泳分離蛋白。將膠放于負極，轉膜裝置浸沒在轉膜緩沖液中，4℃轉膜。將轉膜制得的承載膜置于5%BSA中封閉，脂蛋白脂肪酶和內參抗體過夜后加螢光二抗。TBST清洗后掃描儀掃描并截圖分析。得到去除背景的灰度圖像，計算目的條帶的陰影。

1.2.5 HE染色

標本用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋，切片（5 μm厚），HE染色，鏡下觀察。

1.2.6 LPL免疫組織化學染色

石蠟切片常規脫水至水化，PBS沖洗5 min，3次，3%過氧化氫封閉10 min，高溫修復抗原（沸水浴30 min），自然涼至室溫，PBS沖洗5 min，3次，正常山羊血清37℃封閉30 min，一抗孵育（1∶200），4℃過夜；滴加生物素標記的二抗（羊抗兔IgG），37℃20 min，辣根酶標記的鏈酶親和素（三抗），37℃30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明后中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。

1.2.7 脂周蛋白免疫組織化學染色

石蠟切片常規脫水至水化，PBS沖洗5 min，3次，3%過氧化氫封閉10 min，高溫修復抗原（沸水浴30 min），自然涼至室溫，PBS沖洗5 min，3次，正常山羊血清37℃封閉30 min，一抗孵育（1∶200），4℃過夜，滴加生物素標記的二抗（兔抗羊IgG），37℃20 min，滴加AP，30 min后生理鹽水洗3次，堿性磷酸酶染色劑染30 min左右，自來水沖洗10～15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。深藍色為陽性結果。

1.2.8 統計處理

采用SAS統計軟件進行統計分析，計量資料中正態分布數據用x±s表示，兩組數據之間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。非正態分布數據采用中位數，上四分位數～下四分位數（M，P25～P75）表示，P＜0.05認為有統計學差異。

2 實驗結果

2.1 大體標本觀察

植入后1周，可見實驗組與對照組脂肪團塊都有血管長入。隨著時間的延長，兩組脂肪移植物，尤其是對照組，體積逐漸變小，移植物表面油滴增多。植入后2周，可見脂肪組織外側出現纖維囊包裹；隨著時間延長，脂肪組織外側纖維囊逐漸增厚。

2.2 LPL的Westen Blot結果

實驗組LPL在1周、2周、3周和4周相對表達水平為（1.64±0.12）、（1.53±0.13）、（1.21±0.21）和（1.12±0.18）；對照組LPL為（1.59±0.14）、（0.65±0.14）、（0.52±0.13）和（0.47±0.13）。提示1周時兩組無顯著差異，2周、3周和4周兩組差異顯著（圖1）。

2.3 LPL免疫組化染色結果

光鏡下觀察，存活的脂肪細胞、纖維結締組織中的血管內皮細胞和前體脂肪細胞可表達LPL。在移植前可見脂肪組織完整，脂蛋白脂肪酶陽性細胞存在（圖2）。第1周，實驗組和對照組鏡下無明顯差異；第2周，實驗組和對照組LPL表達增加，且實驗組顯著高于對照組；第3周，鏡下可見實驗組和對照組纖維結締組織增生明顯，對照組纖維化高于實驗組，實驗組表達LPL的細胞密度高于對照組；第4周，兩組纖維化更加明顯，實驗組表達LPL的細胞密度高于對照組，但是總體兩組都呈下降趨勢（圖3）。

2.4 脂周蛋白免疫組化染色結果

光鏡下可見存活脂肪細胞脂滴周邊區域陽性表達，為圓環狀。移植前，脂周蛋白在脂肪細胞上呈強陽性環形表達（圖4）。移植后1周，兩組無明顯差異；移植后2周，可見脂肪細胞脂滴周圍脂周蛋白表達下降，表達區域界限模糊，對照組脂周蛋白表達的下降幅度比實驗組更加明顯，細胞間隙比對照組更寬；移植后3周，可見實驗組和對照組都呈缺血性壞死，實驗組存活細胞數量高于對照組；移植后4周，可見間質組織增生，前體脂肪細胞散布其中；移植后4周，兩組存活的脂肪細胞數量下降，前體脂肪細胞增加，實驗組的前體細胞數量大于對照組（圖5）。

圖1 移植早期脂蛋白脂肪酶W estern blot變化趨勢Fig.1 The trends of LPL exp ression in the early stage after adipose transp lantation by W estern blot

圖2 移植前LPL免疫組化Fig.2 The results of LPL immunohistochem istry beforeadipose transp lantation

圖3 移植后早期LPL免疫組化Fig.3 The results of LPL immunohistochem istry in the early stage after adipose transplantation

圖4 移植前脂周蛋白免疫組化Fig.4 The results of perilipin immunohistochem istry before adipose transp lantation

圖5 移植后早期脂周蛋白免疫組化Fig.5 The results of perilipin imm unohistochem istry in the early stage after adipose transp lantation

3 討論

脂肪注射已廣泛應用于美容及整復手術。但是脂肪移植物具有較高的吸收率和較低的存活率，移植時仍需矯枉過正或重復注射，以達到滿意的效果。

目前，脂肪組織的獲得、提取和保存等都有了相應的經驗標準。實驗證明，血供是脂肪存活的重要因素[5-7]。Yoshimura等[4]利用SVF輔助脂肪移植以改善脂肪移植效果，引起廣泛關注。用膠原酶處理脂肪組織，可得到大量的SVF細胞，SVF細胞經離心、培養可獲得ASCs。通過自體培養可得到大量ASCs，但是培養技術復雜，培養周期長，污染風險性大，而且需要一期獲取ASCs，二期獲得脂肪，將兩者混合植入。而SVF細胞可一期實現移植，具有更高的安全性[4，8]。鑒于SVF更為廣泛的臨床應用范圍，我們認為針對SVF輔助移植的研究更具有現實意義，而且SVFs輔助移植與ASCs輔助移植具有共同的效果。

LPL是脂質代謝中最重要的酶之一[9]，主要由脂肪和肌肉細胞合成后分泌至細胞外，并進一步轉運至鄰近毛細血管內皮表面的硫酸類肝素上，錨定于此處發揮生理功能。通過一系列生理作用，外源性甘油三酯轉化為自由脂肪酸，進入脂肪細胞中，再發生一系列變化，成為脂肪細胞本身的甘油三酯。脂蛋白脂肪酶發揮作用使得機體各種組織能夠利用來自食物攝取和肝臟合成的脂肪。但是各組織的脂蛋白脂肪酶對機體脂質代謝的作用各不相同。目前普遍認同的是白色脂肪組織（WAT）中的LPL活性升高有助于機體脂質的貯存，棕色脂肪組織（BAT）的LPL則與機體產熱有關，而骨骼肌的LPL活性升高有利于機體利用能量。LPL在脂肪組織（AT）中的活性及其在肌肉組織內的相對活性決定了脂肪是用于貯存或是供能。而與脂肪移植密切相關的是白色脂肪。LPL在人體內分泌代謝研究中是重要的研究對象，但涉及該關鍵酶含量和活性變化的報道卻較少。Hudson等[10]通過比較人體不同部位脂肪組織LPL的活性和脂肪細胞大小來確定較好的脂肪供區，認為大腿部的脂肪組織最適合于脂肪移植。Yost等[11]比較抽脂術前后人體血清中LPL的表達和活性，認為抽脂術后3個月內人體血清中LPL表達升高，與體重降低后的代償相關。此外，未發現其他相關報道。

在脂肪組織中表達LPL的細胞包括成熟脂肪細胞，前體脂肪細胞和血管內皮細胞。本研究結果顯示，SVF可提高脂肪組織的LPL表達，并且移植后2周開始，對照組和實驗組呈現差異性變化，究其原因，應當結合ASCs在脂肪存活中的分化機制來探討。ASCs在脂肪存活中具有如下作用：①ASCs可分化為血管內皮細胞，加速脂肪移植物的血管化和再成活[12-13]。新鮮分離的自體SVFs或培養的自體ASCs均參與脂肪移植物的血管化進程。而ASCs在脂肪移植物的血管化進程中的作用一般在移植1周左右開始顯現，血管密度的增加提高了脂肪細胞的存活率[14]，從而提高了LPL表達陽性細胞的存活率。②ASCs可分化成脂肪細胞，成為脂肪移植物的組成部分。ASCs與脂肪細胞體外聯合培養有利于ASCs向脂肪細胞的分化[15-16]，1～2周內，LPL mRNA開始表達升高并可持續于整個誘導過程，而非成脂誘導干細胞的LPL表達則可忽略不計。本實驗第2周開始，實驗組LPL陽性細胞數量明顯升高，可能與SVF提高脂肪組織中脂肪前體細胞數量有關，前體細胞血管密度增加后，在有較充分氧氣和營養的情況下需要大量貯存甘油三酯而使得LPL含量大幅增加。

組織學和Western blot檢測可以看出，盡管SVF可提高早期LPL表達，但比起移植前脂肪組織，LPL表達仍是下降的。由此可見，盡管SVF可以提高細胞生存率，提高LPL表達，但無法改變移植早期在缺血缺氧的條件下脂肪細胞大量壞死的趨勢。

總之，SVF可提高脂肪細胞遠期存活率，促進LPL表達和細胞成脂，提高脂肪移植效果。今后我們將繼續研究相關機制和SVF的作用方式，進一步探索促進脂肪組織LPL表達及促進脂肪細胞成脂的方法，為改進脂肪移植效果提供新的策略。

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Effect of SVF Cells on the LPL Expression after Fat Transp lantation

FAN Qi,ZHENG Danning,YU Li,WANG Jian, LI Pengfei.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHENG Danning(E-mail:zhengdan218@hotmail.com).

Objective To explore the effect of adipose stromal vascular fraction(SVF)cells on the LPL expression after fat transplantation.M ethods Freshly isolated SVFs(experimental group)were mixed with adipose tissue and then injected under the back skin of nudes random ly on one side.In the same manner,the mixture of physiological saline and adipose tissue(control group)were injected on the other side.Immunohistochem istry for perilipin,immunohistochem istry for LPL and western blot for LPL were combined to explore the trends of LPL expression at 1,2,3 and 4 weeks.Results According to the results of western blot and immunohistology of LPL,the levels of LPL started to decrease as early as the transplantation in both groups.And the expression of LPL in the experimental group was higher than the control group at 2,3 and 4 weeks after implantation.Immunohistology of perilipin indicated no remarkable changes in the viable adipocyte zone during the first week.The adipose cells decreased day to day in both group.And 2,3 and 4 weeks after implantation there were more survived adipose cell in the experimental group.Conclusion SVF can improve the expression of LPL in transplanted adipose tissue.It begins to make effects at the second week post-implantation.It may be related to its effect on the adipose cell survival and the adipogenic differentiation of ASCs.

Adipose-derived stromal cells;Fat transplantation;Lipoprotein lipase;Perilipin

R622+.9

A

1673－0364（2015）03－0148－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.008

2015年3月21日；

2015年5月6日）

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

鄭丹寧（E-mail：zhengdan218@hotmail.com）。