Sox9誘導人臍血干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究

張 軍 張耀明 王正輝 張 青 羅花南 鄭國璽 侯 瑾 王波濤 楊葉葉 趙小燕 史艷霞

·論著·

Sox9誘導人臍血干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究

張 軍 張耀明 王正輝 張 青 羅花南 鄭國璽 侯 瑾 王波濤 楊葉葉 趙小燕 史艷霞

目的探討Sox9基因對臍血干細胞向軟骨細胞分化的影響。方法體外分離培養人臍血干細胞，采用脂質體轉染Sox9載體質粒，觀察轉染后細胞形態的變化，免疫組化染色觀察collagenⅡ、aggrecan的表達，RT-PCR檢測collagenⅠ、collagenⅡ、aggrecan的mRNA水平變化，Western blot檢測collagenⅡ的表達變化。結果Sox9對臍血干細胞形態無明顯影響，與傳統方法誘導組相比，Sox9轉染后可明顯促進臍血干細胞向軟骨細胞分化。結論Sox9對臍血干細胞的軟骨分化有很強的調控作用，臍血干細胞可作為組織工程軟骨一種良好的種子細胞。

臍血干細胞分化Sox9基因

軟骨自身修復能力非常有限，組織工程軟骨構建為修復軟骨缺損提供了一條新途徑。但是，軟骨細胞在體外培養過程中存在老化、去分化現象，隨著傳代次數的增加，細胞逐漸向成纖維細胞分化。因此，獲得充足的種子細胞是組織工程軟骨構建中的重點之一。間充質干細胞具有多向分化潛能，存在于脂肪、臍血、胎盤、牙髓、腺體等組織中。人臍血間充質干細胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC）具有來源豐富、易于采集和保存、無異體排斥、長期傳代不變性等優點，具備多向分化潛能，可分化為軟骨細胞、心肌細胞等多種細胞[1]，在組織工程領域具有廣闊的應用前景。然而臍血干細胞向軟骨細胞誘導分化率低，限制了其在軟骨組織工程領域的應用。早期研究表明，Sox9（SRY-related high mobility group-box gene 9）在軟骨分化發育過程中是一個不可或缺的調控因子[2-3]。因此，本研究嘗試將臍血干細胞過表達Sox9，與傳統誘導方法進行比較，觀察其是否能促進臍血干細胞向軟骨細胞分化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高糖DMEM培養基、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；透明質酸酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；FBS（Invitrogen公司，美國）；Ⅱ型膠原一抗（小鼠抗人，Neomarker公司，美國）；Aggrecan單克隆抗體（羊抗人，Santa Cruz公司，美國）；Sox9質粒（Gene Copoeia公司，美國）；RT-PCR mix（Toyoboco公司，日本）；CO2孵箱（Thermo公司，美國）；熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.2 臍血干細胞的分離培養

本研究經西安交通大學倫理委員會批準。臍血采集后24 h內處理，將臍血用PBS以1∶1稀釋，室溫下靜置20 min或至血漿與紅細胞界面形成后，吸取血漿層，2 000 r/min離心5 min，棄上清，用5 mL α-MEM懸浮細胞，按2∶1的體積比加到淋巴細胞分離液（密度1.077 g/mL）表面，使兩者間形成一清晰界面。2 000 r/min離心20 min，離心后輕輕吸取懸于分離液面的白膜層，D-Hank's洗滌，1 000 r/min離心4 min。用5 mL α-MEM培養基重懸細胞，獲得hUCMSCs懸液。按1×106cells/cm2的密度將上述細胞懸液接種于25 cm2的培養瓶，37℃培養箱中培養；72 h后更換培養液，之后2 d更換1次培養基。鑒定參照文獻[4]的方法。

1.3 轉染Sox9質粒

將臍血干細胞以5×105的密度接種于6孔板內，細胞長至80%～90%時轉染質粒。參照LipofectamineTM2000說明書進行操作。

1.4 臍血干細胞向軟骨細胞誘導分化

取第3代hUC-MSCs進行誘導分化。實驗分為3組：陰性對照組（未處理組），Sox9轉染組，傳統方法誘導組（高糖DMEM培養基中加入5%胎牛血清，100 nM地塞米松，50 μg/mL抗壞血酸，10 ng/mL TGF-β，10 ng/mL IGF-Ⅰ，1×ITS+）；誘導后4%多聚甲醛固定，常規切片，甲苯胺藍染色，光鏡觀察。

1.5 RT-PCR檢測基因的表達

按照試劑盒說明提取總RNA，使用cDNA逆轉錄反應試劑盒進行逆轉錄，將反轉錄的cDNA按照以下體系（25 μL體系）進行PCR擴增。

β-actin引物序列：正義鏈5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'，反義鏈5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'；Aggrecan引物序列：5'-GCAGTCTTCCAACCCAA-3'，反義鏈5'-ACATCT CCAGCCTCCTTA-3'；CollagenⅠ引物序列：5'-CTTGGTCTCGTCACAGATCA-3'，反義鏈5'-CTTTTAACGGAGGATGTGCTATTTGGC-3'；CollagenⅡ引物序列：5'-GGAGCAGCAAGAGCAAGGAGAAG-3'，反義鏈5'-TGGACAGCAGGCGTAGGAAGG-3'；Sox9引物序列：5'-GAACGCACATCAAGACGGAG-3'，反義鏈5'-TCTCGTTGATTTCGCTGCTC-3'。反應條件：94℃2 min，94℃30 sec，53℃30 sec，72℃30 sec，循環35次。反應產物于1%凝膠中進行電泳。凝膠成像系統分析各電泳條帶的吸光度，得出mRNA的相對表達量。

1.6 免疫學檢測

細胞貼壁后4%多聚甲醛固定，Triton室溫下浸泡25 min，0.01 M PBS洗3次，每次5 min；滴加一滴工作用血清（試劑A），常溫孵育15 min，后分別滴加（1∶200）Ⅱ型膠原（CollagenⅡ）、aggrecan單克隆抗體50 μL，4℃冰箱過夜（＞18 h）；加入二抗稀釋液稀釋二抗，培養箱內孵育15 min；0.01 M PBS洗3次；顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測

誘導2周時，加入單去污細胞裂解液，4℃下以12 000 g離心3 min，取上清，用Lowry法定量蛋白，依次加入封閉液、抗CollagenⅠ、CollagenⅡ抗體、辣根過氧化物酶標記二抗，化學發光劑反應，X線曝光。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 細胞形態

轉染Sox9載體48 h后細胞形態無明顯變化，細胞生長良好；而傳統誘導組細胞大量脫落，細胞數量減少（圖1）。

2.2 臍血干細胞向軟骨細胞誘導分化

甲苯胺藍染色顯示，傳統方法誘導2周后可見蛋白多糖的表達，而Sox9誘導1周后即可見蛋白多糖的明顯表達（圖2）。

2.3 軟骨細胞特異性標志物的表達

免疫組化染色證實臍血干細胞向軟骨細胞的分化，經Sox9誘導1周aggrecan、collagenⅡ染色與傳統誘導液誘導2周無明顯差別（圖3）。

采用RT-PCR檢測軟骨細胞特異性標志物的mRNA表達水平。臍血干細胞經Sox9載體轉染后，Sox9處于較高的表達水平。蛋白多糖與Ⅱ型膠原的表達隨培養時間延長表達量逐漸增強，1周時兩者都有較高的表達，而Ⅰ型膠原始終未明顯表達。而在傳統誘導組，隨著誘導時間的延長，各組基因表達量逐漸增強，2周時蛋白多糖與Ⅱ型膠原的表達與1周時Sox9組的表達無明顯差別，并且Ⅰ型膠原、Sox9的表達量也逐漸增強（圖4）。

Western blot結果顯示，Sox9轉染組1周時Ⅱ型膠原表達量很高，而傳統誘導組表達量很低，兩者有明顯差別。2周時兩組表達量無明顯差別（圖5）。

圖1 hUCMSCs形態觀察（40×）Fig.1Histological observation of hUCMSCs(40×)

圖2 hUCMSCs形態觀察（甲苯胺藍染色，40×）Fig.2Histological observation of hUCMSCs (toluidine blue staining,40×)

圖3 hUCMSCs免疫組化染色觀察（100×）Fig.3Immunohistochemical detection of hUCMSCs(100×)

圖4 RT-PCR檢測不同時間點Sox9、CollagenⅠ、CollagenⅡ和蛋白多糖的基因表達Fig.4 The mRNA expression of Sox9,collagen I,collagen II and aggrecan at different time point detected by RT-PCR

圖5 Western blot檢測不同時間點CollagenⅡ的表達Fig.5The expression of CollagenⅡat different time point detected by Western blot

3 討論

本研究中，我們通過梯度離心法成功從臍血中分離單核細胞，細胞形態類似成纖維細胞，通過免疫標記證實為臍血干細胞。加入傳統誘導液后，細胞大量脫落，數量明顯減少，而Sox9轉染組細胞形態無明顯變化，細胞生長良好。

既往應用基因技術誘導干細胞向軟骨細胞分化的研究，主要聚焦于TGF-Β、BMPS等外用生長因子上，軟骨誘導液多含有TGF-Β、IGF等生長因子，往往導致軟骨細胞表型肥大，不利于軟骨細胞的誘導分化[6]；且由于生長因子位于細胞外，其濃度受環境影響，發揮的生物學效應難以控制。Sox9是細胞內的調控因子，本實驗表明Sox9能誘導臍血干細胞向軟骨細胞分化，同時抑制了Ⅰ型膠原的表達，進一步表明Sox9具有抑制細胞肥大的作用。

Sox9屬于Sox家族[5]，主要在成軟骨祖細胞及軟骨細胞中表達。Akiyama等[7]報道，Sox9在小鼠肢芽間充質細胞中失活，將阻斷其向軟骨細胞分化，最終導致四肢軟骨組織的缺乏。研究表明，Sox9可以與軟骨分化過程中重要基因的啟動子結合并啟動其轉錄。這些靶基因包括col9a1、col9a2、col9a3、col2a1、col11a、aggrecan1等[8]，它們的蛋白產物為各型膠原和蛋白聚糖，是軟骨細胞外基質的重要組成成分。這些胞外基質蛋白不僅對維持軟骨組織的結構很重要，而且也參與調控軟骨細胞分化[9]。研究表明，Sox9在干細胞體外分化為軟骨細胞過程中也扮演重要角色。Furumatsu等[10]在人間充質干細胞中過表達Smad3后發現，該基因能通過激活Sox9轉錄活性顯著促進干細胞向軟骨細胞分化。本研究中，我們發現傳統方法誘導組隨誘導時間延長，Sox9表達逐漸增強，同時蛋白多糖、Ⅱ型膠原表達也逐漸增強，我們推測誘導液可能通過增強Sox9的表達促進干細胞向軟骨細胞的分化。較傳統誘導組相比，Sox9轉染組1周時軟骨細胞特有的基因蛋白多糖、Ⅱ型膠原已明顯表達，而誘導液組2周時其表達量才逐漸增強。說明Sox9轉染后可明顯加快臍血干細胞向軟骨細胞的誘導分化。

大多數體外誘導干細胞向軟骨細胞分化的實驗，采用“三維”培養模式，是為了更好地模擬體內軟骨形成過程中細胞聚集的過程，但該方法的細胞團中心由于營養、氧氣等不足，限制了細胞或組織的增殖。目前單層培養也有一定的局限性，比如原代軟骨細胞在單層培養條件下會失去軟骨細胞表型。但本實驗發現，Sox9轉染的臍血干細胞在單層培養條件下顯示出較強的軟骨分化能力，說明Sox9基因對臍血干細胞軟骨分化有很強的調控作用。

綜上所述，臍血干細胞具有良好的軟骨分化潛能，較傳統誘導方法相比，Sox9誘導可明顯加快臍血干細胞向軟骨細胞誘導分化，而臍血干細胞可作為組織工程軟骨構建的良好的種子細胞。

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Chondrogenic Differentiation of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Induced by Sox9

ZHANG Jun1,ZHANG Yaoming2,WANG Zhenghui3,ZHANG Qing3,LUO Huanan3,ZHENG Guoxi3,HOU Jin3,WANG Botao3,YANG Yeye3,ZHAO Xiaoyan3,SHI Yanxia3.

1 Department of Otolaryngology,the Affiliated Hospital of Yan'an University,Yan'a 717100,China;
2 Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Yan Chang County,Yan'an 717100,China;
3 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,The Second Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004, China.Corresponding author:WANG Zhenghui(E-mail:ehui4298@163.com).

ObjectiveTo investigate the effect of Sox9 gene on inducing the chondrogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells.MethodsHuman umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs)were obtained by microdissection and digestion,and cultured in monolayer.The growth velocity and morphological changes of hUCMSCs were observed after Sox9 transfection.The expression of collagenⅡand aggrecan were detected by immunohistochemistry.The mRNA expression of collagenⅠ,collagenⅡand aggrecan were detected by RT-PCR,and collagenⅡcontent was detected by western blot.ResultsThe Sox9 gene had no significant effect on the morphology of hUCMSCs,and significantly accelerated the differentiation of hUCMSCs to chondrocytes compared with the traditional induction group.ConclusionSox9 gene can regulate the differentiation of hUCMSCs,and hUCMSCs can be used as seed cells for cartilage tissue engineering.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Differentiation;SRY-related high mobility group-box gene 9

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）04－0221－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.001

2015年3月29日；

2015年5月5日）

國家自然科學基金資助項目（81000416）；中央高校基本科研業務費專項資金（西安交通大學國際合作類）；西安交通大學第二附屬醫院重點項目基金。

717100陜西省延安市延安大學附屬醫院耳鼻喉科二病區（張軍）；717100陜西省延安市延長縣人民醫院耳鼻喉科（張耀明）；710004陜西省西安市西安交通大學第二附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科（王正輝，張青，羅花南，鄭國璽，侯瑾，王波濤，楊葉葉，趙小燕，史艷霞）。

王正輝（E-mail：ehui4298@163.com）。