四川省不同來源核盤菌菌株的可溶性蛋白和酯酶同工酶的電泳圖譜分析

李沛利, 劉 丹, 葉華智, 嚴(yán)吉明

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 成都 611130)

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四川省不同來源核盤菌菌株的可溶性蛋白和酯酶同工酶的電泳圖譜分析

李沛利, 劉 丹, 葉華智, 嚴(yán)吉明*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 成都 611130)

選取四川省不同地區(qū)、不同寄主、代表不同致病性水平和不同菌絲體親和性表現(xiàn)的核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌株進(jìn)行可溶性蛋白和酯酶同工酶電泳分析，結(jié)果表明：不同寄主來源、不同致病性水平、不同菌絲體親和性表現(xiàn)的核盤菌菌株間的可溶性蛋白和酯酶同工酶電泳圖譜條帶數(shù)量及分布相對穩(wěn)定，僅部份弱帶在出現(xiàn)頻率、染色強(qiáng)度或遷移距離上有一定的變化，表現(xiàn)出種的特征和種內(nèi)的異質(zhì)性，在分類上具有一定的意義，可溶性蛋白和酯酶同工酶電泳分析可作為核盤菌分類和遺傳多樣性分析的一個(gè)生化指標(biāo)。

核盤菌; 電泳分析; 可溶性蛋白; 酯酶同工酶

蛋白質(zhì)(包括酶)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,其電泳圖譜的差異在一定程度上反映了菌株間的遺傳差異,這種差異受生理因素和環(huán)境條件的影響較小,而與供試菌株的親和群、致病性或菌株來源有一定的相關(guān)性[1-6],這種相關(guān)性在不同病原菌中表現(xiàn)不同。Reynolds等[1]的研究表明,不同立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)融合群(AG1～AG5)間的可溶性蛋白圖譜差異顯著,而相同融合群內(nèi)菌株的可溶性蛋白圖譜存在一定相似性。劉曙照等[2]研究發(fā)現(xiàn),稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)各生理小種群、生理小種乃至相同生理小種不同菌株間的可溶性蛋白圖譜都存在不同程度的差異。伍光慶等[3]的研究表明，不同菌株的可溶性蛋白、酯酶和酸性磷酸酯酶的譜帶差異與病菌的致病性不直接相關(guān)。胡春錦等[4]發(fā)現(xiàn)引起水稻紋枯病的立枯絲核菌(R.solani)的AG-l-IA融合群的可溶性蛋白圖譜條帶數(shù)目與菌株致病力強(qiáng)弱成正比。趙桂東等[5]發(fā)現(xiàn),江蘇大麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)的酯酶圖譜與菌絲融合群或亞群大體一致,根據(jù)酶譜劃分的菌株類型與地理分布有一定的聯(lián)系,而與菌株的致病力無關(guān)。趙小明等[6]發(fā)現(xiàn),引起棉花黃萎病的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)不同致病類型的菌系有獨(dú)特的酯酶同工酶譜,并與營養(yǎng)體親和群有一定的關(guān)系。

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)是世界分布的寄生物,可侵染作物引起菌核病。將蛋白質(zhì)和酶用于核盤菌種群結(jié)構(gòu)的研究,國內(nèi)外已有報(bào)道,Russo等[7]在核盤菌菌核中發(fā)現(xiàn)了一種在營養(yǎng)菌絲中沒有或含量很低的特異性蛋白(development-specific protein),認(rèn)為這種蛋白在核盤菌的生活史中可作為一種貯藏蛋白,合成菌核萌發(fā)所需的氮源或氨基酸。Petersen等[8]對近源的核盤菌(S.sclerotiorum)、小核盤菌(S.minor)和三葉草核盤菌(S.trifoliorum)進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn),這3個(gè)種的菌核中都含有這種特異蛋白,其中小核盤菌的development-specific proteins遷移率略大于另外2種。劉萬仁等[9]將同工酶電泳分析結(jié)果作為分類地位有分歧的核盤菌種類微觀鑒定的輔助依據(jù),為核盤菌種內(nèi)分化鑒定提供了新指標(biāo)，并發(fā)現(xiàn)核盤菌種群南方菌系與北方菌系的可溶性蛋白稍有差異。李新鳳等[10]發(fā)現(xiàn),對腐霉利表現(xiàn)不同抗性水平的6株菌株間,蛋白質(zhì)及酯酶圖譜存在明顯差異。迄今,對不同寄主來源、不同致病性水平、不同菌絲體親和性表現(xiàn)的核盤菌菌株間的電泳圖譜有無差異還缺乏全面的研究。

四川是受菌核病危害較為嚴(yán)重的一個(gè)地區(qū),除了油菜外,萵苣、向日葵、白芷、板藍(lán)根、益母草、紅花等蔬菜和藥用植物受到的危害也較重。因此,本研究選取四川省不同地區(qū),不同寄主,代表不同致病性水平和不同親和性表現(xiàn)的核盤菌菌株進(jìn)行可溶性蛋白和酯酶同工酶電泳分析,以確定四川省不同來源的核盤菌菌株間的電泳圖譜有無差異,為掌握四川省核盤菌的遺傳多樣性及抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的15個(gè)核盤菌(S.sclerotiorum)菌株分別代表不同致病性水平[11]和不同菌絲體親和性[12],其中,14個(gè)來自四川省不同地區(qū),1個(gè)來自內(nèi)蒙古,菌株編號見表1。以寄主為澤瀉,疑似為小核盤菌(S.minor)的菌株(編號為91)為參照。

表1 供試菌株

1.2 樣品制備

將各菌株接種在PDA平板上,20 ℃培養(yǎng)1個(gè)月,收集菌核。用無菌水浸洗24 h后用提取緩沖液(Tris-Gly,pH 8.3)浸洗30 min,吸干菌核上的水分,置于-20 ℃下冷凍備用。制樣時(shí)加入3倍菌核體積的提取緩沖液及少許酸洗過的石英砂,在冰上研磨勻漿,4 ℃，15 000 r/min離心2次,每次30 min,所得上清液立即使用或保存于-20 ℃[9]。

1.3 可溶性蛋白電泳分析

采用不連續(xù)的垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)[13],濃縮膠濃度為5%(pH 6.8),分離膠濃度為10%(pH 8.8),均為過硫酸銨聚合,電泳緩沖液為Tris-Gly (pH 8.3)。電泳在4 ℃下進(jìn)行,穩(wěn)壓輸出,初始電壓80 V,待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后調(diào)電壓為160 V。電泳完畢后立即剝膠,用0.25%考馬斯亮藍(lán)R250染色至條帶清晰,隨后用7%的乙酸脫色數(shù)次至譜帶清楚后照相,計(jì)算相對遷移率[14],相對遷移率Rf=蛋白質(zhì)分子遷移距離(cm)/染料遷移距離(cm)。每個(gè)菌株重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.4 酯酶同工酶電泳分析

采用和1.3相同的電泳系統(tǒng)和電泳條件,染色方法參考吳少伯等[15]的方法,待出現(xiàn)清晰條帶后用蒸餾水沖洗膠板,保存于7%的乙酸中供觀察、照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 核盤菌可溶性蛋白電泳分析

測定結(jié)果表明,供試菌株的可溶性蛋白條帶數(shù)介于8～14條之間,在凝膠的上、中、下各部都有分布,其中多條為著色快、色澤深的主蛋白帶。由圖1可知,帶P1(相對遷移率Rf=0.32)、P2(相對遷移率Rf=0.43)、P4(相對遷移率Rf=0.69)和P5(相對遷移率Rf=0.74)穩(wěn)定地出現(xiàn)在15個(gè)核盤菌(S.sclerotiorum)中,在疑似為小核盤菌(S.minor)的菌株(編號91)中沒有出現(xiàn),可認(rèn)為是核盤菌菌株的特異性譜帶。帶P3(相對遷移率Rf=0.49)是16個(gè)供試菌株共有的,只是在菌株91中表現(xiàn)為唯一的主蛋白帶,而在15個(gè)核盤菌菌株中該譜帶顏色的寬度和深度有所變化(在8個(gè)菌株中表現(xiàn)為1級帶,在7個(gè)菌株中表現(xiàn)為2級帶)。表明15個(gè)核盤菌菌株的可溶性蛋白條帶數(shù)量及分布相對穩(wěn)定,僅部份弱帶在不同菌株間出現(xiàn)的頻率、遷移距離或染色強(qiáng)度上有所變化;菌株91與供試核盤菌菌株既有同源性又有區(qū)別。

圖1 核盤菌可溶性蛋白電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic patterns of soluble proteins of Sclerotinia sclerotiorum

2.2 酯酶同工酶電泳分析

從圖2可以看出,供試菌株的酯酶同工酶酶帶均位于凝膠的中下部,且酶帶較少(僅2～3條)。菌株91具有3條核盤菌(S.sclerotiorum)菌株沒有的特異性條帶,其中E2(相對遷移率Rf=0.65)和E5(相對遷移率Rf=0.87)為1級帶,E1(相對遷移率Rf=0.47)為2級帶,說明菌株91的酯酶同工酶酶譜與核盤菌菌株有明顯的區(qū)別。染色較深的1級帶E3(相對遷移率Rf=0.72)和染色較淺的3級帶E4(相對遷移率Rf=0.78)穩(wěn)定出現(xiàn)在15個(gè)核盤菌菌株中,充分體現(xiàn)了供試的15個(gè)核盤菌菌株的同源性,帶E3和E4可視為核盤菌的特異性譜帶。另外少數(shù)菌株還具有一條染色較淺的3級帶E6(相對遷移率Rf=0.95),說明供試核盤菌菌株在遺傳背景上也存在一定的差異。

圖2 核盤菌酯酶同工酶電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic patterns of esterase isozyme of Sclerotinia sclerotiorum

3 討論

可溶性蛋白和同工酶電泳分析可在群體、種及種下水平對樣品進(jìn)行分析,從而澄清一些有爭議的類群或作為一些類群分類的輔助手段[16],該方法在許多菌物分類和鑒定中已得到了應(yīng)用[1-6],在核盤菌中的應(yīng)用也有一些報(bào)道[7-10]。本試驗(yàn)對16個(gè)供試菌株進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn),疑似為小核盤菌(S.minor)的菌株與15個(gè)核盤菌(S.sclerotiorum)菌株的可溶性蛋白酶譜和酯酶同工酶酶譜在表現(xiàn)差異的同時(shí),也顯示出彼此的親緣關(guān)系,參考形態(tài)學(xué)特征及相對遷移率[8],菌株91應(yīng)屬于小核盤菌(S.minor)。由電泳圖譜還可以看出,15個(gè)核盤菌(S.sclerotiorum)菌株都含有一條色澤深,著色快的主蛋白帶P2,說明該條帶在15個(gè)核盤菌菌株中含量都較高。根據(jù)相對遷移率推測該蛋白帶可能就是Russo等人發(fā)現(xiàn)的特異性蛋白的譜帶[7],也是核盤菌中較為保守的特異性條帶。

供試的14個(gè)核盤菌菌株來自四川省不同地區(qū)、不同寄主、具有不同致病性水平、不同菌絲體親和性表現(xiàn),它們的可溶性蛋白和酯酶同工酶譜帶數(shù)量及分布相對穩(wěn)定,僅某些弱帶在不同菌株間出現(xiàn)的頻率、染色強(qiáng)度或遷移距離有一定的變化,說明四川省核盤菌菌株的可溶性蛋白酶譜和酯酶同工酶酶譜在種內(nèi)差異較小,Casale對世界各地的核盤菌屬真菌的分離物總蛋白和11種不同酶的電泳分析也得出了相似的結(jié)論[17]。

核盤菌群體的遺傳多樣性,還可通過分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行測定[18-21]。劉曉紅[18]用9個(gè)隨機(jī)引物對川西平原30個(gè)不同菌絲體親和群(MCGS)的油菜核盤菌菌株進(jìn)行RAPD擴(kuò)增,不同菌絲體親和群(MCGS)的菌株間、不同地方及同一地方不同菌株間表現(xiàn)出一定的遺傳多樣性,但菌株間的遺傳距離不大(GD≤0.333),表明菌株間具有相似的遺傳背景。Mandal等[19]用分子標(biāo)記對24株代表印度10個(gè)不同州的核盤菌菌株進(jìn)行測定,用21個(gè)RAPD引物標(biāo)記后,大多數(shù)菌株表現(xiàn)出90%以上的遺傳相似性;所有的菌株產(chǎn)生幾乎相同的ITS-RFLP圖譜,不同菌株的ITS區(qū)變化很小。段曉莉等[20]用微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記,對來自歐洲和中國的30個(gè)核盤菌菌株進(jìn)行測定,30個(gè)核盤菌分離物具有較高的遺傳相似性,物種水平的Nei遺傳多樣性指數(shù)為0.139 3,Shannon多樣性指數(shù)為0.248 8。不同菌株群體的Nei遺傳距離都較小,為0.009 6～0.049 6;群體結(jié)構(gòu)與地理來源沒有明顯的直接關(guān)系。張強(qiáng)等[21]用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對陜西省的144株油菜菌核病菌和18株不同寄主來源的菌核病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明,陜西省油菜菌核病菌存在豐富的SRAP多態(tài)性(不同地區(qū)的144株菌株的多態(tài)性比例為88.4%,相似系數(shù)為0.346～0.936,不同寄主的18株菌株的多態(tài)性比例為84.9%,相似系數(shù)為0.358～0.976),其遺傳多樣性與地理來源相關(guān)性不明顯,與寄主種類及致病力也無顯著相關(guān)性。

通過各種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行測定[18-21]與本文得出的結(jié)果都表明,大田內(nèi)大多數(shù)核盤菌菌株的遺傳背景相似,雖表現(xiàn)出一定的遺傳多樣性,但差異不明顯,這種差異與菌株的寄主來源、地理來源、親和群關(guān)系不明顯。雖然不同地區(qū)、不同寄主來源、不同致病性水平、不同菌絲體親和性表現(xiàn)菌株間的電泳圖譜表現(xiàn)出的信息量不如SRAP分子標(biāo)記等方法豐富,但操作相對簡單,從生理、生化的角度揭示了核盤菌群體的遺傳多樣性,反映出種的特征和種內(nèi)的異質(zhì)性,在分類上具有一定的意義。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Electrophoretic patterns of soluble protein and esterase isozyme patterns ofSclerotiniasclerotiorumfrom different origins in Sichuan

Li Peili, Liu Dan, Ye Huazhi, Yan Jiming

(College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

Soluble protein and esterase isozyme patterns ofSclerotiniasclerotiorumstrains from different host in different region, with various pathogenicities and MCGs, were studied by polyacrylamide gel electrophoresis. The electrophoretic patterns and distribution of soluble protein and esterase isozyme were relative stable in all tested strains, except little changes of weak band in frequencies of occurence, staining intensity and migration distance between different strains. Although a little genetic information was showed in the electrophoretic patterns, the results could be used in practice ofS.sclerotiorumclassification as an additional taxonomic criterion.

Sclerotiniasclerotiorum; electrophoretic analysis; soluble protein; esterase isozyme

研究簡報(bào)ResearchNotes

2014-05-08

2014-12-16

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2012JY0117)

S 435.654

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.026

* 通信作者 E-mail：jimingyan@126.com