湖南省辣椒上首次發現象耳豆根結線蟲

王 劍, 宋志強, 成飛雪, 程菊娥, 張德詠*, 劉 勇*

(1. 湖南省農業科學院, 長沙 410125; 2. 湖南省農業科學院植物保護研究所,園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點實驗室, 長沙 410125)

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湖南省辣椒上首次發現象耳豆根結線蟲

王 劍1, 宋志強2, 成飛雪2, 程菊娥2, 張德詠2*, 劉 勇2*

(1. 湖南省農業科學院, 長沙 410125; 2. 湖南省農業科學院植物保護研究所,園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點實驗室, 長沙 410125)

應用線蟲比較形態學、同工酶技術和IGS-PCR技術,對采自湖南省永州地區辣椒上的根結線蟲進行種類鑒定。結果表明,該病原線蟲為象耳豆根結線蟲(Meloidogyneenterolobii),這是首次在湖南地區發現象耳豆根結線蟲。

象耳豆根結線蟲; 辣椒; 鑒定; 湖南省

象耳豆根結線蟲(Meloidogyneenterolobii)是一種在農業生產上具有潛在危害性的植物病原線蟲。其寄主范圍廣,且在番茄上能突破Mi基因抗性[1-2]。該線蟲1983年在我國海南省儋州市象耳豆樹上被發現[3]。近年來,在海南、廣州等地發現該線蟲寄生于豆科、茄科、葫蘆科的多種重要經濟作物以及番石榴等水果,且造成較大危害[1,4]，但在湖南未見其發生分布的報道。2012-2013年,我們在湖南永州地區進行蔬菜根結線蟲病害調查時發現,一種根結線蟲病原嚴重危害該地區辣椒生產,造成辣椒萎蔫,早衰,產量損失極大。我們從形態、同工酶以及分子生物學上對該病原線蟲進行了種類鑒定,以期為準確鑒定與控制該病害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

從湖南省永州市零陵區接履橋鎮接履橋村大象組一農戶辣椒地采集感病辣椒,挑取卵囊室內接種于辣椒上擴繁保存、備用。

1.2 病原線蟲形態觀察

觀察雌蟲、雄蟲及2齡幼蟲(J2)的形態特征,并測量特征值,共測量20 條。拔取感病辣椒,清水洗根,在倒置顯微鏡下用鑷子和解剖針分離成熟雌蟲于清水中,參照馮志新等[5-6]方法制作會陰花紋臨時裝片,利用Olympus顯微鏡(BX51型)觀察雌蟲會陰花紋并拍照。

挑取根中卵囊,室內孵化,分離、收集2齡幼蟲,并采用熱殺死、TAF固定液固定,制備臨時裝片,在顯微鏡下觀察、測量體長、體寬、口針長、DGO和尾長等參數[7]。

1.3 同工酶分析

病原線蟲的酯酶(Est)和蘋果酸脫氫酶(MDH)分析參照Esbenshade等的方法[8],電泳分析采用DYCZ-24D型垂直板電泳槽,凝膠板大小為83 mm × 75 mm,聚丙烯酰胺膠厚度0.75 mm,分離膠與濃縮膠濃度分別為12%和5%。采用DYY-6C型電泳儀電泳,80 V 1 h，然后200 V 3 h。電泳緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。每孔道加入2個年輕雌蟲的酶浸提液,以已鑒定的南方根結線蟲(M.incognita)樣本作為對照。Est和MDH染色過程參照Esbenshade等[9]的方法。將同一膠條先后放入Est和MDH染色液中分別顯色20～30 min,直至出現清晰條帶,待顯色完全后漂洗3次,放入10%醋酸中固定,拍照。并參照Esbenshade等[8]的標準判斷Est和MDH譜型,初步確定根結線蟲種類。

1.4 分子生物學鑒定

1.4.1 ITS序列分析

利用ITS-PCR技術對采集自辣椒上的病原線蟲進行分子鑒定。ITS區序列擴增通用引物[10]為F:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′,R:5′-ATCCACCGATAAGGGTAGAA-3′。采用單條線蟲擴增。將消毒清洗后單條J2線蟲放入含有5 μL TE buffer(pH 8.0)的0.2 mL PCR管中,加入蛋白酶K,使其終含量為0.5 mg/mL。混勻后65 ℃消化1 h,95 ℃滅活10 min,10 000 r/min 離心1 min,取上清液10 μL作為PCR反應模板。25 μL PCR反應體系中其他試劑參照《分子克隆實驗指南》[11]。擴增條件為:94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個循環；72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。割膠回收PCR產物并送華大基因測序,測得的序列在GenBank中進行在線BLAST。

1.4.2 IGS2序列分析

根據ITS序列比對結果,參照Long[12]等的方法設計象耳豆根結線蟲IGS2序列特異引物:Me-F(5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′),Me-R(5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′),進行IGS2 PCR擴增與序列比對。擴增方法同上。利用DNAMAN將所得序列與已報道的象耳豆根結線蟲序列進行同源性比對。

2 結果與分析

2.1 病原線蟲形態鑒定

湖南永州辣椒上的根結線蟲雌蟲蟲體呈梨形或橢圓形;頸明顯突出,頭區無環紋,唇盤圓盤狀,略突起;口針細長,基部球粗大,椎體部與桿部等長;排泄孔位于近中食道球處;種群內雌蟲會陰花紋有差異,呈卵圓形或橢圓形,線紋平滑,背弓低至高,無明顯側線。2 齡幼蟲蠕蟲形,頭區略縊縮,無環紋,口針細長,椎體部與桿部分界明顯,基部球大而圓,尾部透明區明顯,末端鈍圓(圖1～2)。其J2和雌蟲的形態測量值與Yang報道的象耳豆根結線蟲稍有差異[3],主要表現在J2口針較長,體寬較大,尾部稍短,而雌蟲體寬大于Yang描述的象耳豆根結線蟲雌蟲體寬。J2及雌蟲主要形態測量值見表1。

圖1 象耳豆根結線蟲2齡幼蟲及雌蟲形態Fig.1 Morphology of the second-stage juveniles and female of Meloidogyne enterolobii

圖2 象耳豆根結線蟲雌蟲會陰花紋Fig.2 Female perineal pattern of Meloidogyne enterolobii

病原線蟲Nematode蟲態Stage體長/μmBodylength體寬/μmBodywidth口針長/μmStyletlengthDGO/μmDorsalesophagealglandorifice尾長/μmTaillength辣椒上病原線蟲Pathogenicnematodeonpepper2齡幼蟲The2ndjuveniles434.5(387.7～507.8)17.3(15.0～21.1)14.4(13.4～15.3)3.8(2.9～5.4)50.9(45.8～58.2)雌蟲Female630.3(486.7～821.3)623.8(283.8～687.5)15.9(12.6～16.4)5.2(3.7～6.2)—

續表1 Table 1(Continued)

病原線蟲Nematode蟲態Stage體長/μmBodylength體寬/μmBodywidth口針長/μmStyletlengthDGO/μmDorsalesophagealglandorifice尾長/μmTaillength象耳豆根結線蟲M.enterolobii2齡幼蟲The2ndjuveniles436.6(405.2～472.9)15.3(13.9～17.8)11.7(10.8～13.0)3.4(2.8～4.3)56.4(41.9～63.4)雌蟲Female735.0(541.3～926.3)606.8(375.7～809.7)15.1(13.2～18.0)4.9(3.7～6.2)—

1) 表中象耳豆根結線蟲的數據引自Yang,1983。

The data ofM.enterolobiiwas cited from Yang,1983.

2.2 同工酶分析

已知南方根結線蟲Est和MDH酶帶分別為H1和N1型[8]。對辣椒病株上分離的根結線蟲群體的Est和MDH同工酶圖譜(圖3)分析表明，該病原線蟲Est有2條主要酶帶,為VS1-S1型,MDH有1條酶帶,為N1a型,這與報道的象耳豆根結線蟲酶帶譜型一致[1]。所以根據病原線蟲Est-MDH表型圖譜,初步判定從湖南永州地區辣椒上分離到的根結線蟲為象耳豆根結線蟲。

圖3 南方根結線蟲和辣椒上病原線蟲的Est和MDH同工酶圖譜Fig.3 The esterases(Est) and malate dehydrogenase(MDH) phenotypes of Meloidogyne incognita and pathogenic nematode on pepper

2.3 分子生物學分析

利用線蟲ITS序列通用引物F/R進行PCR擴增,南方根結線蟲及分離獲得的病原線蟲都得到800 bp左右條帶(圖4a),將該病原線蟲擴增序列割膠回收后送華大基因測序,在GenBank中BLAST,結果表明，該病原線蟲的ITS序列與象耳豆根結線蟲同源性達99%。

利用象耳豆根結線蟲IGS2序列特異引物進行PCR擴增,分離的病原線蟲擴增到236 bp目的片段(圖4b),與Long等[12]報道的片段大小一致,其序列與象耳豆根結線蟲同源性為100%,而南方根結線蟲沒有擴增到特異性目的條帶。

圖4 南方根結線蟲與辣椒上病原線蟲ITS-PCR及IGS-PCR 結果Fig.4 The results of ITS-PCR and IGS-PCR of Meloidogyne incognita and pathogenic nematode on pepper

3 結論與討論

本研究從比較形態學、同工酶電泳以及分子生物學方面對湖南永州地區感病辣椒植株上分離的病原線蟲進行了種類鑒定。結果表明,該病病原線蟲為象耳豆根結線蟲。據報道,在我國象耳豆根結線蟲僅在海南、廣州地區被發現[1,4,13],在湖南未曾報道有象耳豆根結線蟲的分布。本研究表明,從湖南永州地區感病辣椒植株上分離的根結線蟲為象耳豆根結線蟲,這是除海南、廣州外又一地區發現象耳豆根結線蟲。卓侃等曾推測象耳豆根結線蟲在我國南方亞熱帶、熱帶地區可能有較廣的分布[1],本研究是對其推測結果的一個有力證明,這對了解象耳豆根結線蟲的分布情況及其潛在危險具有非常重要的意義。

辣椒是湖南廣泛栽培的蔬菜品種之一,在以往的調查中發現湖南地區根結線蟲種類主要為南方根結線蟲[14],其在湖南對辣椒的侵染并不嚴重,未見引起明顯的產量損失。而從湖南永州地區感病辣椒植株上分離的根結線蟲種群對辣椒侵染率極高,發病地塊病株率達100%,感病辣椒萎蔫嚴重,出現明顯早衰,產量損失極大。象耳豆根結線蟲種群在湖南地區的發現,為有效采取檢疫、防治措施,防止該病原線蟲的傳播擴散及其危害提供必要的依據。而象耳豆根結線蟲是否會成為湖南地區繼南方根結線蟲后的又一重大根結線蟲病原,還有待于進一步的研究。

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(責任編輯：楊明麗)

First report ofMeloidogyneenterolobiion pepper in Hunan Province

Wang Jian1, Song Zhiqiang2, Cheng Feixue2, Cheng Ju’e2, Zhang Deyong2, Liu Yong2

(1. Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 2. Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops in Hunan Province, Changsha 410125, China)

The root-knot nematodes on pepper collected from Yongzhou， Hunan Province were identified by using morphological characters, isozymes and IGS-PCR. The results suggested that the root-knot nematodes wereMeloidogyneenterolobii. It was the first report ofMeloidogyneenterolobiiin Hunan Province.

Meloidogyneenterolobii； pepper； identification； Hunan Province

2014-04-18

2014-07-31

公益性行業(農業)科研專項(201103018)

S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.035

* 通信作者 E-mail:dyzhang@163.com, haoasliu@163.com