混合藻中藍藻的檢測

崔建升，康紅利

（1.河北科技大學環境科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術實驗室，河北石家莊 050018）

大量工業廢水和生活污水排入自然水體中，導致水體富營養化現象。近幾年來，藍藻水華的發生相當頻繁，中國常見的水華藻［1］：藍藻占81%，綠藻、硅藻、甲藻各占6%，裸藻占1%。藍藻中的銅綠微囊藻可以分泌產生毒素，對人類、動植物和環境的危害日益引起人們的關注［2］。

傳統的飲用水處理工藝不能完全有效地去除味道、氣味或毒素。因此，建立一個適用于水處理的可以快速有效提供原水藍藻信息的預警系統是非常重要的［3］。目前藍藻生物量的檢測方法［4］很多，但高效液相色譜法步驟繁瑣、預處理步驟復雜；流式細胞儀計數法儀器昂貴、不適合進行原位測量；《水和廢水監測分析方法》中的標準方法群落計數法，主觀性大、耗時耗力，而且只能在實驗室中完成。鑒于這些方法不能實現藻類的快速、原位測量而失去了檢測的意義和進行水華預警的優勢。因此，需要建立一種可以快速、自動、原位測量藍藻的方法［5－6］。

藍藻的主導光合色素為葉綠素a 和藻藍蛋白［7－8］。藻藍蛋白是淡水藍藻所特有的色素，有很強的熒光特性并且不干擾葉綠素的熒光。研究發現藻藍蛋白可在藍藻體內從其他藻類干擾中被檢測到（見圖1）。與葉綠素a的活體熒光不同，藍藻的藻藍蛋白活體熒光與細胞個數有典型的聯系［9］。可通過檢測藻藍蛋白熒光強度快速檢測藍藻生物量。

圖1 藻藍蛋白與葉綠素a激發發射波長對比Fig.1 Algal blue protein and chlorophyll a excitation emission wavelength comparison

熒光法因具有靈敏度高、儀器易于操作、樣品可進行直接測試、避免了運輸過程中的雜質干擾、檢測速度快等優勢，被國內外研究者廣泛應用于浮游植物的鑒別［10－13］。目前利用熒光技術檢測藍藻生物量的方法已經有很多相關的報道［14－16］，并且商業化的綠藻測定儀和藻類分析儀也已經出現，但是大多數研究均使用了藻藍蛋白的最優波長作為檢測波長，均沒有考慮水體中其他色素對于測定結果的影響以及現場測定儀受到自然水體中熒光物質的影響，使得熒光法測定浮游植物受到了局限，而且中國國內對于現場檢測儀還處于研發階段，并沒有成品出現。

本研究通過對銅綠微囊藻活體、藻藍蛋白提取液以及葉綠素a提取液熒光光譜的掃描，在考慮水體中最常見色素葉綠素a影響的條件下確定了藍藻的檢測波長，建立了藍藻生物量與藻藍蛋白特征熒光之間的線性關系，并對該波長條件下葉綠素a的影響進行了分析，為現場檢測儀的研制提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種

實驗選用的藻種分別為藍藻（銅綠微囊藻；BG11 培養基）、綠藻（蛋白核小球藻、斜生柵藻；BG11培養基）、硅藻（湖北小環藻；SCI培養基）、甲藻（光甲藻；119培養基）、裸藻（纖細裸藻；HUT 培養基），均來自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

將藻種置于恒溫培養箱中擴大培養，培養溫度為25 ℃，光照強度為2 000Lux，濕度調節至75%RH，光暗周期比為12h∶12h，培養基在使用前于高壓滅菌鍋中滅菌21min，然后在無菌操作下轉入玻璃三角瓶內，按藻種與培養基的體積比為1∶5轉接后放入人工氣候箱中進行培養。

1.2 葉綠素a和藻藍蛋白提取液的獲得

葉綠素a 的提取參考《水和廢水監測分析方法》［17］，根據JESPERSEN公式計算葉綠素a 濃度［18］；藻藍蛋白采取反復凍融法［19］提取，根據BENNETT 公式得到藻藍蛋白濃度［20］。

1.3 儀器和測定方法

主要使用熒光分光光度計（PF－5301PC，日本島津公司）測定室溫條件下的藍藻活體熒光。采用10 mm 比色皿，光狹縫為5nm。

2 結果與分析

2.1 激發波長的選擇

根據研究浮游植物與藍藻的最高相關性可變熒光是在橙紅色激發590～650nm 之間［14］。選定7種不同的熒光激發波長（λEx＝590，600，610，620，630，640，650nm），掃描熒光發射波長在450～750 nm 范圍內的藍藻活體、葉綠素a提取液、藻藍蛋白提取液。不同激發波長下的發射光譜圖結果如圖2所示。

從圖2a）中可以看出隨著激發波長的增長，葉綠素a提取液的發射光譜圖波形不發生改變，但是逐漸向上移動，在發射波長670nm 左右的熒光強度值逐漸增大。激發波長在590 nm 處最小，650nm處最大。從圖2b）中可以看出隨著激發波長從590，600，610nm 逐漸增加到620nm，藻藍蛋白提取液的熒光強度逐漸增大，在620nm 處熒光強度值達到最大，在630，640，650nm 處檢測不到藻藍蛋白的特征熒光峰。從圖2c）中可以看出隨著激發波長從590，600，610，620nm逐漸增加到630nm，銅綠微囊藻原液的熒光強度逐漸增大，在630nm 處達到最大，640，650nm處檢測不到藻藍蛋白的熒光峰。

葉綠素a提取液在590nm 處熒光強度最低，并且藻藍蛋白提取液和銅綠微囊藻原液在590nm 處均能檢測到藻藍蛋白的特征熒光峰，因此激發波長確定為590nm。

圖2 不同激發波長下的發射光譜圖Fig.2 Emission spectra under different excitation wavelength

2.2 發射波長的選擇

選定9種不同的熒光發射波長（λEm＝600，610，620，630，640，650，660，670，680nm），掃描熒光發射波長在450～750nm 范圍內的藍藻活體、葉綠素a提取液、藻藍蛋白提取液。不同發射波長下的激發光譜圖結果如圖3所示。

圖3 不同發射波長下的激發光譜圖Fig.3 Excitation spectrum diagram under different emission wavelength

觀察光譜圖從圖3a）中可以看出發射波長在600，610，620，630nm 時，除去蒸餾水的散射峰向后移動外，其他激發波段的熒光強度值基本不變，在640，650，660nm 處熒光激發光譜圖逐漸向上移動，熒光強度值增大。從圖3b）中可以看出發射波長在620，630nm 處檢測不到藻藍蛋白的熒光峰，發射波長在640nm 處熒光強度值達到最大，隨發射波長從650，660，670nm 逐漸增加到680nm，熒光強度值逐漸減小。從圖3c）中可以看出在620，630，640nm 處檢測不到藻藍蛋白的熒光峰，650nm處熒光強度值最大，隨發射波長從660，670nm 逐漸增加到680nm，熒光強度值逐漸減小。

藻藍蛋白提取液在640nm 處，銅綠微囊藻原液在650nm 處熒光強度最高，并且銅綠微囊藻原液在640nm 處檢測不到藻藍蛋白的特征熒光峰，葉綠素a提取液在640nm 和650nm 波長下，于590nm 激發波長處的熒光強度相差不大，因此發射波長確定為650nm。

2.3 原藻液的影響

將6種培養成熟的藻，稀釋一定的倍數以后，在λEm＝650nm，λEx＝590nm，狹縫寬度為5nm 條件下，掃描原藻液的激發光譜和發射光譜，如圖4和圖5所示。

從圖4中可以看出只有銅綠微囊藻的激發波長熒光中心是在650nm 左右，其他藻類均在685 nm 左右，圖中熒光強度的高低與藻細胞的濃度有關。從圖5中激發光譜圖中可以看出只有銅綠微囊藻在600nm 左右有一個較強的熒光中心，其他藻類除去水的衍射峰之外熒光強度均很低。所以選用熒光發射波長λEm＝650nm，激發波長λEx＝590nm作為測定浮游植物中的藍藻時的檢測波長，對其他藻種的影響不大。

2.4 藍藻生物量與藻藍蛋白熒光強度的關系建立

將培養成熟的銅綠微囊藻稀釋成不同的濃度梯度，分別在各個濃度梯度下測定藍藻生物量與藻藍蛋白熒光強度的關系。由圖6可以看出，藍藻細胞密度與藻藍蛋白的熒光強度呈良好的線性關系，r＝0.999 4。進一步證明了采用λEx／λEm＝590nm／650nm 來檢測藍藻具有可靠性。

3 結 論

圖5 發射波長650nm 下的激發光譜圖Fig.5 Excitation spectra under the emission wavelength of 650nm

圖6 藍藻細胞濃度和藻藍蛋白熒光強度值之間的關系Fig.6 Relationship between algal cell density and algal blue protein fluorescence intensity value

通過對銅綠微囊藻活體、藻藍蛋白提取液以及葉綠素a提取液熒光光譜的掃描，確定了從其他浮游植物中測定藍藻中藻藍蛋白選用熒光發射波長λEm＝650nm，激發波長λEx＝590nm 作為檢測波長。以銅綠微囊藻590nm／650nm（λEx／λEm）作為檢測波長，測定了不同藻種的熒光光譜圖，結果表明，其他藻種在該波長下的熒光強度值很小，對于藻藍蛋白熒光強度值熒光甚微，且銅綠微囊藻生物量與藻藍蛋白熒光強度呈正相關關系，回歸方程為y＝0.900 8x－1.712 6，r＝0.999 4。表明該方法具有特異性強、對其他浮游植物影響性小，可以直接對藻液進行檢測，省去了復雜的前處理過程，可應用于水體中藍藻的原位快速測量。

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