星斑川鰈神經肽Y基因cDNA克隆與表達特性研究

郭湘云，李 華，鄭風榮，王 波，徐宗軍，丁倩倩，趙 盟，李 青

（1.大連海洋大學 水產與生命科學學院，遼寧 大連116023；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266000）

神經肽Y（Neuropeptide Y，NPY）是由瑞典科學家Tatenoto K［1］于1982年首次從豬腦組織中得到的一種單鏈多肽，在結構上，與酪酪肽（Peptide Tyrosine Tyrosine，PYY）和胰多肽（Polypeptide，PP）十分相似，故認為同屬胰多肽家族［2－3］。NPY基因包含4個外顯子和3個內含子，成熟活性肽由36個氨基酸組成，迄今為止，所研究的脊椎動物發現都含有NPY基因，并且物種之間的NPY保持高度同源性［4－5］。在魚類的食欲調控因子中，NPY被認為是調控攝食最為關鍵的因子，而且NPY已經被證實對攝食有明顯的促進作用，如金魚、草魚等［6－9］。但關于NPY與星斑川鰈攝食的研究還未見報道。

星斑川鰈（Platichthysstellatus）隸屬硬骨魚綱（Osleichthyes），鰈形目（Pleuronectiformes），鰈科（Pleuronectidae），川鰈屬（Platichthys），分布于我國黃海中北部海區沿岸，星斑川鰈繁殖力強，性情溫馴，適宜于進行集約化養殖，是重要的新型海水養殖經濟種類。目前關于調節星斑川鰈攝食的研究多數是調整飼養結構及養殖環境等方面因素，很少有從分子水平上研究星斑川鰈食欲與調控機理及其影響因子，從而揭示其攝食調控和能量代謝關系的研究。本實驗以星斑川鰈為材料，克隆了星斑川鰈神經肽NPY基因cDNA序列，并利用Real－time PCR檢測了NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的分布情況，并研究了饑餓對NPY在腦組織表達的影響，從而為進一步研究NPY在促進星斑川鰈攝食方面的分子機制而建立一定的分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

星斑川鰈取自日照海洋水產資源增殖站，健康養殖魚共60尾，采樣時間為2013－10，體表完好，長約15 cm，重約200g。解剖取魚的腦組織立即存放于液氮中，備用。

1.2 RNA提取

取正常健康的星斑川鰈的腦組織，采用TRIZOL Reagent（康為世紀）提取總RNA，使用RNase Free DNaseⅠ（TaKaRa）對總RNA進行處理以除去DNA污染，最終定容于無RNase水。用核酸蛋白測定儀測定OD260／OD280比值以檢測RNA純度并計算濃度，同時進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。純化后的總RNA溶液保存于－80℃。

1.3 NPY cDNA的5′RACE和3′RACE

根據本實驗室構建的星斑川鰈腦組織的轉錄組庫中的NPY部分序列，利用Primers 5.0設計引物GSP2、GSP1（表1），以通用引物UPM（universal primer）作為上、下游引物擴增目的片段，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification試劑盒（Clontech）說明書進行反轉錄、5′RACE擴增和3′RACE擴增。3′RACE程序為：95℃4min；95℃45s，63℃45s，72℃1min，共30個循環；72℃10min。5′RACE程序為95℃4min；95℃45s，65℃45s；72℃30s，共30個循環；72℃10min。取5μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（生工生物工程有限公司）切膠回收5′RACE產物及3′RACE產物，將PCR產物純化后連接到PTZ57R／T（Thermo）載體上，轉化到感受態細胞E.ColiDH5α中，涂平板、挑菌，經PCR檢測陽性克隆后進行擴培，采用試劑盒提取質粒DNA（生工生物工程（上海）有限公司），送上海桑尼公司進行測定序列，將5′RACE和3′RACE獲得的基因片段連接為NPY cDNA全長，用引物NPY－F和NPY－R進行全長驗證，并與GenBank中已知序列進行比對。

表1 實驗使用引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.4 生物信息學分析與系統進化樹的構建

測序結果在NCBI數據庫中利用BLAST進行同源性比對；利用DNAstar軟件進行序列拼接；用GENSCAN軟件確定正確的開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；用ProtParam預測理化性質；用PredictProtein預測其二級結構；用獲得的星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種神經肽Y氨基酸序列進行Clustal W比對，然后用 MEGA 5.0軟件 Neighbor－joining法（bootstrap values為1 000）進行分子進化分析；利用SOPMA軟件進行蛋白質二級結構預測；利用I－TASSER軟件進行蛋白質三級結構預測。

1.5 星斑川鰈NPY基因的組織表達及饑餓對其表達影響

采用Realtime PCR法檢測NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的相對表達量和在不同饑餓程度時腦組織中的表達水平變化。

取自日照市海洋水產資源增殖站的健康星斑川鰈50尾，運回實驗室馴養5d，試驗期間海水溫度保持在18℃左右，每天換水，充氧。共設置3個試驗組，每處理組3組重復，每組重復5尾星斑川鰈，分別在0，24，72h饑餓時間在3組試驗魚中取樣，每組隨機抽取5尾魚取其腦組織，使用Prime ScriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒（TaKaRa）進行反轉錄得到cDNA。

根據得到的星斑川鰈NPY cDNA全序列，設計特異性引物Q－NPY F和Q－NPY R，以β－actin作為內參引物（表1）。以各組織RNA和不同饑餓時間的腦組織RNA為模板，采用Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche）進行Real－time PCR程序采用2步法，其中退火和延伸歸結為一步：95℃10 min；95℃15s，60℃1min，共40個循環。

內參基因在各個組織中的表達相對穩定，在檢測實驗基因的表達水平變化時作為參照物，目的基因的CT值與內參基因的CT值之間的差稱為ΔCT，處理組ΔCT與未處理組ΔCT之間的差為－ΔΔCT，2－ΔΔCT值即為樣品的該基因的相對表達水平，校準樣品恒定為1。利用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），設定差異顯著水平P為0.05，當P＜0.05時即差異顯著，當P＜0.01時即差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 星斑川鰈NPY基因cDNA序列序列分析和蛋白質結構預測

2.1.1 星斑川鰈NPY基因cDNA序列序列分析

星斑川鰈NPY基因的核苷酸及推導的氨基酸序列（圖1）。利用在線工具GENSCAN（http：∥genes.mit.edu／GENSCAN.html）分析得知：該cDNA全長559bp，5′UTP含有13個堿基，3′UTP含有235個堿基，開放閱讀框為210bp，編碼69個氨基酸。

2.1.2 星斑川鰈NPY預測蛋白的一級結構分析

利用在線工具ProtParam（http：∥web.expasy.org）分析編碼的氨基酸，結果顯示其理論分子量為7.98 kDa，分子式為C355H559N95O112S1，總共有1 122個原子組成，預測的等電點（theoretical pI）為5.24，理論推測半衰期（estimated half－life）在哺乳動物網狀細胞中為30h，不穩定系數為85.57，可推斷為不穩定蛋白，總帶正電殘基（Arg＋Lys）為9，總帶負電殘基（Asp＋Glu）為11，總平均親水性（grand average of hydropathicity）為－0.800，脂肪系數（aliphatic index）為83.48。

表2 星斑川鰈NPY氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of NPY in Platichthys stellatus

圖1 星斑川鰈NPY cDNA核酸序列及推導的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of Neuropeptide Y fromPlatichthys stellatus

2.1.3 星斑川鰈NPY預測蛋白的二級結構分析

通過SOPMA軟件進行蛋白質結構分析顯示，在NPY蛋白質的二級結構中，α－螺旋（Alpha helix）占47.83%，β－轉角（Beta turn）占2.90%，無規則卷曲（Random coil）占49.28%（圖2）。

圖2 SOPMA軟件對NPY蛋白二級結構的分析結果Fig.2 Secondary structure of Platichthys stellatus NPY protein analyzed by SOPMA

2.1.4 星斑川鰈NPY預測蛋白的三級結構分析

通過I－TASSER軟件預測了星斑川鰈NPY蛋白質的三級結構（圖3）。

圖3 I－TASSER軟件對NPY蛋白三級結構的分析結果Fig.3 Tertiary structure of Platichthys stellatus NPYprotein analyzed by I－TASSER

2.2 星斑川鰈NPY氨基酸的同源性比較及系統進化分析

2.2.1 星斑川鰈NPY氨基酸的同源性分析

將星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種的NPY氨基酸序列進行BLAST比對，結果表明：星斑川鰈NPY與美國黃蓋鰈（Pseudopleuronectesamericanus）的同源性最高，為100%；與鱸形目花鱸（Lateolabrax japonicus）、鰤魚（Seriolaquinqueradiata）、點帶石斑 魚（Epinepheluscoioides）、軍 曹 魚（Rachycentron canadum）、黑鯛（Acanthopagrusschlegeli）的同源性分別為99%，97%，97%，97%，97%（圖4）。

圖4 星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種NPY氨基酸序列的比較Fig.4 Amino acid sequence aligenment of NPY fromPlatichthys stellatus with other fishes

2.2.2 星斑川鰈NPY系統進化樹分析

通過MEGA5.0軟件構建了星斑川鰈NPY cDNA和氨基酸序列的系統進化樹。結果表明：星斑川鰈NPY與鰈形目魚類的親緣關系較近，與美洲擬鰈聚為一支，這與上述Blast的分析結果一致（圖5，圖6）。

圖5 星斑川鰈NPY cDNA序列與其他脊椎動物的NPY系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the cDNA sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

圖6 星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他脊椎動物的NPY系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

2.3 星斑川鰈NPY mRNA的組織分布分析

采用Real time PCR法，以β－actin基因為內參，檢測NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的表達分布。結果表明：NPY mRNA在腦、心臟、性腺、肝、腸、腎組織都有表達，但在表達量上有明顯差異，心臟和腎組織相對表達量較少。統計分析表明：NPY mRNA在腦、性腺組織中的表達量顯著高于其他組織（P＜0.05）；而在肝和腸組織之間的表達差異不顯著（P＞0.05）（圖7）。

圖7 星斑川鰈NPY mRNA在不同組織中的相對表達水平Fig.7 Relative expression level of NPY mRNA in various tissues of Platichthys stellatus

2.4 饑餓對星斑川鰈NPY mRNA表達水平分析

利用Real－time PCR法檢測了星斑川鰈NPY在不同饑餓程度時腦組織中的相對表達水平。結果表明：NPY在腦組織中的表達隨著饑餓程度的增加而增加，饑餓72h的NPY mRNA相對表達量高于饑餓24h的相對表達量，但差異不顯著（P＞0.05）（圖8）。

圖8 饑餓對NPY mRNA在腦組織中表達的影響Fig.8 Relative expression level of NPY mRNA in brain tissues of Platichthys stellatus

3 討論

本文通過SMART－RACE技術在星斑川鰈腦組織中擴增出NPY cDNA序列，其蛋白質二級結構中，α－螺旋和無規則卷曲含量相對比較高。α－螺旋構象是相當穩定的、最普遍的螺旋形式，無規則卷曲往往與生物活性相關，對外界的理化因子極為敏感。這表明NPY結構穩定、具有較高的生物活性。

同源性分析比較結果顯示，不同物種間NPY存在高度一致性，構建的系統進化樹也同樣地表明了，星斑川鰈NPY與鰈形目魚類的親緣關系較近，與美洲擬鰈聚為一支，這說明了在物種的進化過程中，NPY基因中對于發揮自身功能必須的特定結構，即使經過自然選擇，這些結構依舊被保留了下來，而存在些許的差異，可以認為是適應性選擇的必然結果。

采用Realtime PCR方法檢測了NPY在各組織中的分布情況。結果表明NPY mRNA在腦、心臟、性腺、肝、腸、腎組織均有表達，而且主要在腦組織中表達，該特征與其他硬骨魚類相同［10－11］。NPY分布在不同的組織可能對應著不同的生理功能，下丘腦是動物攝食的調控中心，表達的NPY可以促進動物攝食；NPY分布在星斑川鰈腸道里，可能參與腸道蠕動和消化吸收的調節；分布在心臟，可能與調節心血管活動有關。

本實驗提取不同饑餓處理組的星斑川鰈腦組織RNA，應用Realtime－PCR對NPY mRNA表達量變化進行測定。結果表明：饑餓導致腦組織中的 NPY mRNA表達量升高，這與Lopez－Patino［12］和Silverstein［13－14］的研究結果一致。在對其他魚類的研究中也得出：食物缺乏會使下丘腦中NPY mRNA的表達量升高，例如斑點叉尾（Ictaluruspunctatus）、冬鰩（Rajaocellata）、巴南牙鲆（Paralichthysorbignyanus）等［15－17］；將NPY重組蛋白通過腹腔注射到羅非魚（Oreochromissp.）中，可以促進其攝入食物量及其魚體質量的增加［18］。金魚饑餓24～72h使下丘腦的NPY mRNA含量呈現時間依存的增加；降低金魚的食量至正常水平50%，亦使下丘腦的NPY mRNA明顯增加［19］。

NPY的促進食欲作用與NPY受體有關。研究表明，NPY的Y1和Y5受體參與NPY對食欲的促進作用［20－22］。大量實驗數據證明：NPY生物合成的最初部位主要在下丘腦弓狀核（ARC），少部分分布于室旁核（PVN）、背中核（DMN）等區域，弓狀核NPY神經元的軸突投射到室旁核，經室旁核分泌NPY與特定的受體Y1或Y5結合，進而參與調節攝食過程。研究顯示，在饑餓、劇烈運動、體重降低、泌乳等能量嚴重消耗情況下，下丘腦中的ARC－PVN路徑可被激活，進而增加食欲和攝食量［23－25］。

動物攝食一直是人們研究的重點內容，NPY作為魚類攝食調節的關鍵性因子，研究其調節機理具有重要意義，本研究克隆了星斑川鰈的NPY cDNA序列，預測了其蛋白質的二級和三級結構，為在mRNA水平研究NPY生物學功能提供基礎，為進一步在蛋白水平上研究星斑川鰈的繁殖發育和遺傳育種提供理論基礎。

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