陽離子渦流在線固相萃取/液相色譜－串聯質譜快速分析豬尿液中16種β受體激動劑殘留

祝偉霞，楊冀州，郭慧領，張 莉，王彩娟，張 麗

(河南出入境檢驗檢疫局，河南 鄭州 450003)

β受體激動劑是天然兒茶酚胺類化學合成的衍生物，具有苯乙醇胺結構母核，因結構中含有堿性β-羥胺側鏈，可與細胞膜的β-受體結合而得名，臨床主要用于治療哮喘、肺炎、休克等疾病［1］。在畜牧養殖生產中，β受體激動劑類藥物常被非法添加到飼料中以提高動物生長率和瘦肉率［2］，人類長期亞劑量食用β受體激動劑污染的食品易導致人體器官中毒［3］。農業部196號和235號公告均禁止β受體激動劑作為生長促進劑用于畜牧業，為了逃避政府部門監管，不法商家合成新的苯乙醇胺類替代物用于養殖過程，因此建立一種β受體激動劑多殘留的分析方法對于獸藥殘留監管具有重要意義。

目前，β受體激動劑的多殘留檢測常采用酶聯免疫法(ELISA)［4］、氣相色譜－質譜聯用法(GCMS)［5］、液相色譜 － 串聯質譜法(LC － MS/MS)［6－8］和液相色譜 － 高分辨質譜法(LC －TOF)［9］等。LC －MS/MS 和 LC － TOF 技術是目前測定飼料［10］、尿液［11－12］、動物組織［13－14］和污水［15］等樣品的主要分析方法，樣品前處理采用傳統的離線固相萃取(SPE)法，而離線SPE需要多步驟的溶劑轉移和濃縮，實驗操作繁瑣。近年來研究者開始采用在線SPE技術凈化樣品中β受體激動劑類藥物［16］，但未見有關全自動在線固相萃取聯用質譜技術分析尿液中16種β受體激動劑的報道。本方法采用在線陽離子渦流固相萃取柱凈化，通過對凈化、色譜分離和基質效應等條件的優化，建立了豬尿液中16種β受體激動劑的陽離子渦流在線固相萃取/液相色譜－串聯質譜全自動分析的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TranscendTM在線凈化液相色譜TSQ Ultra串聯四極桿分析系統(美國Thermo Fisher公司);16種β受體激動劑標準品(純度均≥95%，德國Dr.Ehrenstorfer公司);β葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶(德國Merck公司);甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、甲酸(色譜純，美國Fisher公司);甲酸銨(美國Sigma－Aldrich公司);其它試劑均為市售分析純;實驗用水為Millipore純水系統制備的高純水(≥18 MΩ·cm)。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取純度折算為100%的β受體激動劑標準品各20.0 mg，以甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配成質量濃度為200 μg/mL的標準儲備液，于－18℃下保存;分別吸取500 μL標準儲備液，用甲醇稀釋成質量濃度為1 μg/mL的混合標準工作溶液，于0～4℃下保存。取適量的標準混合液添加陰性豬尿液按本方法進行分析，制得基質標準工作溶液，現用現配。

1.3 TurboFlow在線凈化與LC－MS/MS條件

TurboFlow凈化色譜柱為MCXTM(50 mm×0.5 mm);進樣量為100 μL;TurboFlow上樣泵流動相:水(A1)、氨水甲醇(B1)、乙腈－異丙醇－丙酮(4∶4∶2，C1)。液相分離色譜柱為SHISEIDO CAPCELL MGⅡ(150 mm ×2.0 mm，3.0 μm);進樣量為50 μL，流動相為0.1%甲酸甲醇(A2)、0.1%甲酸溶液中含5 mmol/L甲酸銨(B2)，在線凈化和液相梯度洗脫程序見表1。

表1 16種β受體激動劑的在線凈化與液相色譜洗脫程序Table 1 Online MCX SPE and HPLC elution program of 16 β-agonists

質譜條件:電噴霧正離子模式下離子化(ESI+)，蒸發溫度為300℃，毛細管溫度為350℃，噴霧電壓為3 500 V，鞘氣壓力為40 psi，輔助氣壓力為15 psi，檢測模式為選擇反應監測模式(SRM)，檢測離子對、碰撞能量(CE)、聚焦電壓(Tublens)等質譜參數見表2。

表2 16種β受體激動劑的質譜參數Table 2 Mass parameters of 16 β-agonists

1.4 樣品前處理

量取5 mL尿液，加入4 mL 20 mmol/L乙酸銨溶液，用乙酸調至pH 5.2，加入50 μL β葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶液，用乙酸銨定容至10 mL，于37℃下酶解過夜，取出后于4 000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后，進行Online－MCX－SPE和LC－MS/MS全自動測定。

2 結果與討論

2.1 酶解提取條件的優化

16種β受體激動劑按苯環上取代基的差異可分為苯胺與苯酚兩種類型，其中克倫特羅、馬布特羅、西馬特羅等苯胺型激動劑在動物體內主要發生氧化代謝作用，軛合反應率低。但非諾特羅、萊克多巴胺、沙丁胺、特布他林等苯酚型化合物在生物酶的作用下易生成各種軛合物。研究表明，尿液中以軛合物代謝的苯酚型β受體激動劑殘留物≥50%［12］，因此苯酚型化合物測定前常需要酶解。本方法對比了豬尿液(萊克多巴胺和克倫特羅陽性)分別在不酶解與酶解的測定結果，結果表明，在不酶解時萊克多巴胺的測定值為3.4 μg/L，克倫特羅為3.8 μg/L，而酶解后萊克多巴胺測定值為18.2 μg/L，克倫特羅為4.1 μg/L。為同時測定豬尿液中16種β受體激動劑殘留，本實驗選擇將豬尿液在37℃酶解過夜后測定。

2.2 在線固相萃取條件的優化

β受體激動劑結構中含有苯胺和苯酚的氮堿性中心，屬中等極性的疏水物質，在酸性條件下呈陽離子特征，離線SPE方法常采用反相C18和MCX柱凈化。為了建立在線SPE前處理方法，本文考察了5種TurboFlow在線凈化柱的效果，包括反相(Cyclone，Cyclone－p，C18，C18－P)以及陽離子交換MCX柱，結果表明，異丙喘寧、沙丁胺醇、齊帕特羅、特布他林和西馬特羅5種分析物極性強，在Cyclone，Cyclone－p，C18，C18－P柱中富集性差，相對回收率在6.7% ～71.5%之間;而MCX柱是基于尺寸排阻、反相和離子交換等多種混合保留機理的凈化柱，16種分析物在此柱上的回收率均不低于76.2%，因此本方法選擇MCX柱為在線凈化柱。

方法優化了不同淋洗強度對于待測物的影響，分別將5%氨化甲醇與水的體積比設為0∶10，2∶8，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0進行洗脫，16種β受體激動劑的回收率結果顯示，淋洗強度對妥布特羅、克倫特羅、溴代克倫特羅、馬賁特羅、苯乙醇胺A、溴布特羅7種化合物的影響顯著，當氨化甲醇比例增至90%時，16種分析物的回收率不低于85.7%，因此本方法選用5%氨水甲醇水(體積比，9∶1)作為洗脫溶劑。

為了增加分析物洗脫的選擇性，實驗對洗脫流速(10，20，30，50，80，100，150 μL/min)進行了優化。結果表明，10 μL/min和20 μL/min流速不利于化物洗脫，流速在30～80 μL/min范圍時，待測物的響應信號隨流速的增加呈線性增加，80 μL/min后增幅減少。由于在該洗脫模式時，凈化泵和液相色譜泵串聯，為了減少色譜柱的承受壓力，在保證16種分析物洗脫完全的條件下，本方法選用80 μL/min為洗脫流速。

2.3 色譜分離的優化

β受體激動劑類化合物具有疏水的飽和烴鏈，屬堿性或酸堿兩性物質，因此在反相色譜柱上的保留性弱。為增加化合物的保留行為，實驗對比了CAPCELL MGⅡ柱和Sunshell C18兩種色譜柱的分離效果，結果發現:Sunshell C18柱分析異丙喘寧時呈雙色譜峰，西馬特羅、特布他林和齊帕特羅3種物質峰形展寬;而采用CAPCELL MGⅡ柱分析時16種化合物均得到較好的保留。因此，方法選用CAPCELL MGⅡ柱進行分離。

2.4 基質效應的影響

實驗以50 ng/mL標準溶液作為對照，比較了豬尿液加標(50 ng/mL)后直接測定、經TurboFlow凈化分析的相對回收率。測定結果表明，豬尿液未經凈化直接分析時的質譜響應強度降低了42.1%～91.3%，其中對異丙喘寧、沙丁胺醇和克倫特羅的質譜響應值分別降低91.3%，81.4%和88.7%。而經TurboFlow在線凈化后，基質效應明顯降低，而質譜響應值僅降低6.4%～17.2%。因此方法采用TurboFlow在線凈化來有效降低基質干擾，并且采用基質匹配校正曲線進行定量分析。

2.5 靈敏度、線性范圍及回收率

向陰性豬尿液中添加不同濃度的標準溶液，按本方法進行測定，以信噪比S/N≥3為方法檢出限(LOD)，S/N≥10為定量下限(LOQ)，16種 β受體激動劑的 LOD為0.01～0.025 μg/L，LOQ為0.025～0.10 μg/L。在0.01～50 μg/L濃度范圍內，分析物的質量濃度(X，μg/L)與對應峰面積(Y)呈良好線性關系，相關系數(r2)≥0.998 3(見表3)。

采用陰性豬尿液在LOQ，2LOQ和4LOQ水平進行加標回收實驗，色譜圖如圖1所示，每個水平平行測定10次，結果如表3所示。16種分析物的回收率為62.4%～117.1%，相對標準偏差(RSD)為3.9%～16.3%。

表3 方法的驗證數據Table 3 The validated data of method

圖1 豬尿液在定量下限水平的加標回收色譜圖Fig.1 Chromatograms of 16 β-agonists spiking at LOQ level in pig urine

2.6 實際樣品的測定

為驗證該方法的有效性，實驗共收集了213個供港活豬尿樣進行分析。在優化條件下，根據保留時間和特征離子碎片對測定結果進行確證分析，經基質匹配校正曲線定量，檢測結果均為陰性。本方法的測定結果與標準方法［17－18］的測定結果一致。

3 結論

本方法采用Online－MCX－TurboFlow在線凈化，液相色譜分離，串聯四極桿質譜在電噴霧模式下檢測，建立了豬尿液中16種β受體激動劑的在線全自動分析方法。與標準方法相比，本方法減少了離線的手工操作，降低了操作人員的勞動強度，減弱了基質效應。方法學驗證和實際樣品分析表明，該方法的靈敏度高、準確度好、操作簡便，可用于實驗室批量豬尿液中16種β受體激動劑殘留的快速測定和確證。

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