C型凝集素受體Langerin的細胞表達模型構建及功能研究

張曉寧 張宇 羅陽 李巍 姚煦

C型凝集素受體Langerin的細胞表達模型構建及功能研究

張曉寧 張宇 羅陽 李巍 姚煦

目的 構建朗格漢斯細胞特異性C型凝集素受體Langerin體外細胞表達模型。方法 PCR方法獲得Langerin分子的cDNA，克隆入真核綠色熒光蛋白（EGFP）表達載體pEGFP-C1（EGFP位于Langerin的N末端），轉染人腎胚細胞癌HEK 293T細胞后，激光共聚焦顯微鏡檢測EGFP-Langerin融合蛋白的細胞表達情況，流式細胞儀檢測Langerin受體的表達，并進一步檢測轉染表達的Langerin受體對塵螨抗原（nDer p 2）的識別和內吞情況。結果 構建的熒光融合蛋白重組表達質粒轉染HEK 293T細胞后，經PCR及Western印跡檢測證明Langerin轉染及表達成功。重組表達質粒轉染HEK293T細胞后，經流式細胞儀檢測轉染Langerin融合質粒的HEK293T細胞的Langerin受體表達率較轉染前增多約43%，經激光共聚焦顯微鏡檢測顯示綠色熒光標記的Langerin成功表達，并可與紅色熒光素標記的塵螨抗原（nDer p 2）結合，將nDer p 2內吞入細胞內。結論構建的EGFP-Langerin融合蛋白在HEK293T細胞內表達后具有細胞表面受體分子的特征性分布，具有結合、內吞過敏原功能。

樹突細胞；受體，有絲分裂原；重組融合蛋白質類；塵螨科；HEK293細胞；受體，模式識別；Langerin

Langerin（CD207）是一種特異性表達于朗格漢斯細胞表面的C型凝集素受體，其結構是一種Ⅱ型跨膜蛋白，胞外區包括頸部和一個C末端的C型碳水化合物識別區域（C-terminal C-type carbohydraterecognition domain,CRD）［1-2］，其中 CRD 可特異性識別多種含糖基結構的病原菌受體，如，艾滋病病毒、酵母聚糖和白念珠菌、螺旋桿菌、蠕蟲等［3-4］，并具有內吞功能［5］，因此Langerin蛋白在防御人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染、真菌感染免疫等方面起到重要作用［6］。鑒于Langerin的朗格漢斯細胞特異性表達以及與多種糖基結合的特點，推測Langerin可能同樣是富含多糖的過敏原抗原的靶受體。為進一步了解Langerin與過敏原抗原的結合能力及內吞功能，我們構建可表達Langerin熒光融合蛋白的真核表達載體，并轉染工程細胞系HEK293T細胞獲得瞬時表達，以激光共聚焦顯微鏡等技術確定熒光融合蛋白的表達和功能。

資料與方法

一、資料

大腸桿菌DH5α（南京鐘鼎生物技術有限公司惠贈），帶有綠色熒光蛋白的真核表達系統pEGFPC1載體質粒（南京鐘鼎生物技術有限公司）。HEK 293T細胞株（美國模式菌種收集中心ATCC）。Ex Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Xho I和Pst I內切酶、質粒抽提試劑盒和DNA回收試劑盒（日本TaKaRa公司）。轉染試劑陽離子脂質體Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司），人來源的Langerin（CD207）單克隆cDNA（北京義翹神州生物技術有限公司），Alexa Fluor-594熒光染料（美國life公司），來源于人的Langerin（CD207）熒光抗體（APC）（德國美天旎生物技術有限公司），nDer p2抗原（室內，美國Biotechnologies公司）。其余試劑均為國產分析純。

二、方法

1.PCR方法制備Langerin序列片段：PCR反應體系參照TaKaRa公司Ex Taq酶說明書，設25 μl體系。Langerin：上游引物：5′-CTCGAGCTATGACTG TGGAGAAGGAGGCCC-3′；下游引物：5′-CTGCAG TTACGGTTCTGATGGGACATAGGGT-3′。PCR 反應條件：98℃預變性 30 s；98℃變性 10 s，63℃退火30 s，72℃延伸 2 min，循環 25次，72℃延伸 5 min，4℃保存。PCR反應完成后，利用15 g/L瓊脂糖電泳并切膠回收Langerin基因片段。引物中含有Xho I和Pst I酶切位點及保護堿基，膠回收產物Langerin片段，分別以相應的內切酶酶切后連接于pEGFPC1真核表達載體。

2.重組Langerin分子克隆及鑒定：按照TaKaRa公司T4 DNA連接酶的說明，將pEGFP-C1載體質粒和Langerin基因片段用Xho I和Pst I內切酶酶切，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收Langerin基因片段和載體pEGFP-C1。用T4 DNA連接酶連接雙酶切得到的Langerin基因片段和線性化載體，22℃連接2 h。連接產物轉化DH5α感受態細菌，分別以卡那霉素篩選，挑取單克隆抗性菌落擴增，小量抽提質粒并做酶切鑒定，在813 bp對應區域有條帶為陽性克隆，質粒送南京鐘鼎生物技術有限公司測序。

3.真核表達質粒轉染HEK 293T細胞：按照陽離子脂質體Lipofectamin2000說明書將含Langerin的真核表達質粒轉染HEK293T細胞，以pEGFP-C1空載體為對照。用RPMI培養基（含10%胎牛血清，不含青鏈霉素）將HEK293T細胞形成單細胞懸液，按照每孔5×105細胞接種于12孔細胞培養板37℃5%CO2培養24 h，貼壁細胞數量達80%～90%時，用3 ml不完全RPMI培養基（不含胎牛血清）洗滌細胞兩次，加入1 ml不含胎牛血清的RPMI培養基。根據Lipofectamin2000說明書操作，質粒與脂質體終濃度比為1 μg：2 μl，將轉染混合物逐滴加入已鋪好細胞的12孔板中混勻后，5%CO2、37℃培養過夜，轉染48 h后觀察結果。

4.激光共聚焦顯微鏡檢測重組EGFP-Langerin融合蛋白的表達：將轉染48 h的HEK293T細胞收集，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，4%甲醛固定30 min；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色 10 min 后激光共聚焦顯微鏡檢測熒光融合蛋白的表達情況。

5.PCR和Western印跡驗證Langerin表達：

（1）PCR驗證Langerin基因表達：HEK293T細胞轉染48h后，收集細胞，每106個細胞用1ml TRIzol試劑提取總mRNA，反轉為cDNA后，用小片段Langerin產物驗證Langerin表達。小片段Langerin：上游引物 5′-GGGGACTCATCTACTGG-3′，下游引物5′-GACATAGGGTCGCTTACA-3′；β 肌動蛋白：上游引物 5′-TCTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游引物 5′-AGGCATACAGGGACAGCAC-3′。PCR 反應條件：95℃變性 3 min；94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃60 s，30個循環；最后72℃延伸7 min。PCR反應完成后，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增條帶。

（2）Western印跡驗證 Langerin蛋白表達：HEK293T轉染48 h后，收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，裂解細胞每106個細胞用70 μl RIPA裂解液加入1×蛋白酶抑制劑和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF，美國Sigma公司）抽提總蛋白。將樣品蛋白和蛋白標準參照物依次上樣后，在5%牛血清白蛋白（BSA）溶液中室溫孵育2 h，應用終濃度為2 mg/L。小鼠抗人Langerin一抗室溫孵育2 h，加入過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG與一抗結合，室溫孵育1 h，增強化學發光法（ECL）試劑作用后ChemiDocXRS系統顯影拍照。

6.流式細胞儀檢測HEK293T細胞Langerin受體表達：將轉染48h的HEK293T細胞按約5×105/管收集入1.5 ml微量離心管，以未轉染的HEK293T細胞為陰性對照，根據Langerin熒光標記抗體說明書加入Langerin-APC熒光抗體，避光孵育后上機檢測。

7.激光共聚焦顯微鏡檢測融合蛋白對戶塵螨過敏原（nDer p 2）攝取：收獲轉染后48 h的HEK293T細胞，根據熒光染料Alexa Fluor-594（分子探針）標記天然純化過敏原nDer p 2，標記后蛋白終濃度為0.6g/L。分3組加入35mg/LAlexaFluor-594標記的nDer p 2過敏原，同時分3組加入相同濃度熒光抗體Alexa Fluor-594染料作為對照，在加入過敏原/染料后即刻（0 min）以及37℃、5%CO2孵育15 min、45 min后分別用4%甲醛固定 30 min，PBS洗3次，加入DAPI核染色劑避光孵育10 min，用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光融合蛋白。

結 果

一、EGFP-Langerin融合基因表達載體的構建

PCR方法得到帶有Xho I和Pst I酶切位點的813 bp的Langerin全長編碼框，酶切后連接入PEGFP-C1真核表達載體，構建出Langerin蛋白N末端的融合蛋白表達質粒pEGFP-C1-Langerin。將構建好的重組質粒pEGFP-C1-Langerin用Xho I和Pst I酶切，電泳后得到2條片段，兩片段的位置與理論值一致（一條為813 bp，一條為線性載體片段4 892 bp，圖1），克隆成功。將質粒送南京鐘鼎生物技術有限公司測序，測序結果與Langerin序列一致。

二、Langerin熒光融合蛋白表達

重組質粒轉染HEK293T細胞24 h后，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測到有綠色熒光，提示EGFPLanerin融合蛋白表達質粒在HEK293T細胞中表達。48 h表達綠色熒光蛋白量增多，表達率超過40%（圖 2）。PCR后電泳觀察示，pEGFP-C1-Langerin重組質粒轉染組在233 bp處出現擴增條帶（圖3），pEGFP-C1空載體對照組無條帶出現（結果未顯示）。Western印跡顯示，pEGFP-C1-Langerin重組質粒轉染組在相對分子質量36 000處有條帶證明Langerin表達，pEGFP-C1空載體對照組無條帶出現（圖4）。流式細胞儀檢測細胞表面Langerin受體表達情況，可見未轉染的HEK293T細胞不表達Langerin受體，轉染重組質粒后HEK293T細胞Langerin表達率達43%（圖5）。

三、激光共聚焦顯微鏡檢測Langerin融合蛋白對nDer p 2的攝取能力

在過敏原加入HEK293T細胞后發現，有熒光素標記的過敏原結合于膜表面的EGFP-Langerin融合蛋白上；37℃5%CO2孵育15 min后，熒光素標記的過敏原逐漸分布至細胞內部。37℃5%CO2孵育45 min后，熒光素標記的過敏原進一步內吞至細胞內（圖6）；而僅加入Alexa Fluor-594染料的對照組未見細胞膜表面熒光素結合現象（圖7）。

討 論

圖1 構建的重組質粒pEGFP-C1-Langerin用Xho I和Pst I雙酶切產物 M：標準參照物；1：重組質粒雙酶切產物，兩段大小分別為4 892 bp和813 bp

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測HEK293T細胞轉染pEGFP-C1-Langerin重組質粒融合蛋白的表達 2A：超過40%細胞表達綠色熒光蛋白，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細胞核呈藍色（×400）；2B：帶綠色熒光的融合蛋白（EGFP-Langerin）表達綠色熒光（×600）；2C：DAPI染細胞核呈藍色熒光（×600）；2D：2B與2C圖像融合后，EGFP-Langerin融合蛋白主要表達于細胞膜上（×600）

朗格漢斯細胞是專職抗原提呈細胞［7-8］。C型凝集素受體是包括朗格漢斯細胞在內的樹突細胞表面重要的模式識別受體，其中Langerin是朗格漢斯細胞表面特異性的C型凝集素受體，因其表達的特異性以及抗原提呈、抵抗HIV感染等功能的多樣性受到研究者們的關注。Langerin蛋白的CRD為鈣離子依賴性糖基識別區域，因結構較寬且空間相對穩定，可識別特定結構的糖蛋白或者細胞表面的抗原［8］，通過頸部形成 α 螺旋的三聚體形式［9］，CRD 可識別甘露糖、n乙酰葡糖胺和巖藻糖等糖蛋白配體，如艾滋病病毒、酵母聚糖等，不僅如此，CRD還能夠識別β-1,3葡聚糖，與β葡聚糖結合［10］，并具有內吞功能［11］。多種過敏原均富含糖基結構，我們經過試驗發現，Langerin受體可與多種富含多糖結構的過敏原抗原如戶塵螨等特異性結合（結果未顯示），為進一步證實細胞中Langerin與過敏原抗原結合及內吞情況，我們構建了Langerin細胞表達模型。

圖3 反轉錄PCR檢測HEK293T細胞Lanerin表達 M：標準參照物；1：Langerin小片段；2：β肌動蛋白約180 bp

圖4 Western印跡檢測轉染HEK293T細胞Langerin表達 1：轉染空質粒的HEK293T細胞langerin蛋白無表達；2：轉染重組質粒的細胞表達Langerin蛋白（相對分子質量36 000）；M：標準參照物

圖5 流式細胞儀檢測HEK293T細胞表面表達Langerin受體橫坐標為細胞表面抗Langerin熒光抗體Langerin-APC的紅色熒光強度，縱坐標為細胞相對數量；紅色曲線為未轉染重組質粒的HEK293T細胞情況，藍色曲線為轉染重組質粒后的HEK293T細胞情況

圖6 Alexa Fluor-594標記的nDer p 2與EGFP-Langerin融合蛋白結合及內吞（×600） 6A：0 min時；6B：孵箱孵育15 min時；6C：孵箱孵育45 min時。其中EGFP-Langerin融合蛋白呈綠色熒光（左上角），DAPI染色細胞核呈藍色熒光（左下角），Alexa Fluor-594標記的nDer p 2呈紅色熒光（右上角），三者融合情況（右下角）。隨時間推移可見融合蛋白和nDer p 2結合及nDer p 2內吞 圖7 Alexa Fluor-594染料與HEK293T轉染細胞膜表面EGFP-Langerin融合蛋白結合（×400） 7A：EGFP-Langerin融合蛋白呈綠色熒光；7B：Alexa Fluor-594染料呈紅色熒光；7C：DAPI染色細胞核呈藍色熒光；7D：7A～7C融合后，隨時間推移無明顯變化，均未見明顯結合與內吞情況

HEK293T細胞系是常見的工程細胞，經查證微弱或不表達Toll樣受體，少量表達部分C型凝集素受體，故本實驗選擇HEK293T細胞為轉染細胞。Langerin的CRD與其他具有內吞作用的C型凝集素受體如，DC-SIGN的跨膜結構相似［9］。有研究認為，將熒光蛋白EGFP置于DC-SIGN的C末端可能會影響DC-SIGN對配體的識別［10-11］，故本實驗將EGFP置于Langerin的N末端，構建熒光融合蛋白重組表達質粒，并經PCR及Western印跡驗證Langerin表達成功。經重組質粒轉染后，激光共聚焦顯微鏡發現細胞表達綠色熒光蛋白增多，Langerin表達率增加40%以上，因此可作為Langerin細胞模型進行后續功能研究。激光掃描共聚焦顯微鏡發現，經重組質粒轉染后的Langerin主要為膜表達，試驗中部分綠色熒光蛋白位于細胞膜內，考慮可能是質粒構建過程中設計EGFP位于LangerinN末端，N末端表達的EGFP則表達于膜內。

HEK293T細胞轉染EGFP-Langerin重組質粒48 h后，根據熒光標記的過敏原抗原經過不同孵育時間與Langerin受體結合的情況，進一步證實Langerin的細胞膜表面分布特征以及具有識別、結合、內吞富含糖基結構的功能。

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2014-09-30）

（本文編輯：尚淑賢）

Establishment and functional analysis of a cell model expressing the C-type lectin receptor Langerin

Zhang Xiaoning*,Zhang Yu,Luo Yang,Li Wei,Yao Xu.*Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Yao Xu,Email：drYao_xu@126.com

ObjectiveTo establish a cell model expressing the Langerhans cell-specific C type lectin receptor Langerinin vitro.MethodsThe cDNA of Langerin was obtained by PCR and cloned into a eukaryotic green fluorescent protein（EGFP）expression vector pEGFP-C1 with EGFP located in the N terminal region of the Langerin gene.Then,the recombinant plasmid was transfected into a human embryonic kidney carcinoma cell line HEK293T.Subsequently,laser confocal microscopy was performed to observe the expression of EGFP-Langerin fusion protein,and flow cytometry to measure the expression of Langerin.Laser confocal microscopy was also conducted to visualize the recognition and endocytosis of dust mite antigen （nDer p 2）by Langerin.ResultsPCR and Western blot confirmed the successful transfection of HEK293T cells with the recombinant plasmid as well as the expression of Langerin in the transfected cells.As flow cytometry revealed,the expression level of Langerin in transfected HEK293T cells was increased by 43%compared with untransfected cells.Laser confocal microscopy showed that green fluorescein-labeled Langerin was successfully expressed,and could bind to and endocytose the red fluorescein-labeled antigen nDer p 2.ConclusionsThe fusion protein EGFP-Langerin expressed in HEK293T cells showed the distribution characteristic of cell surface receptors,and could bind to and endocytose allergens.

Dendritic cells;Receptors,mitogen;Recombinant fusion proteins;Pyroglyphidae;HEK293 cells;Receptors,pattern recognition;Langerin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.012

國家自然科學基金（81371735），2014年度亞美醫學基金會（MMAAP）皮膚病項目基金

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所（張曉寧、張宇、羅陽、姚煦）；第四軍醫大學西京皮膚醫院（李巍）

姚煦，Email：drYao_xu@126.com