LEOPARD綜合征一例PTPN11基因突變研究

臧東杰 許星海 周城 張建中 侯艷霞 韓莊 蔣靖

LEOPARD綜合征一例PTPN11基因突變研究

臧東杰 許星海 周城 張建中 侯艷霞 韓莊 蔣靖

目的 對1例LEOPARD綜合征（LS）家系進行PTPN11基因突變檢測，以明確其致病基因。方法收集該LS家系的臨床資料，提取外周血DNA、通過PCR擴增PTPN11基因編碼區的全部外顯子及其側翼序列并測序，以表型正常家系成員及50例健康人為健康對照。結果 發現該家系內患者存在PTPN11基因的錯義突變c.836A＞G，在家系中正常人及對照者未發現上述突變。結論 錯義突變PTPN11的c.836A＞G為導致該家系臨床表型的原因。

LEOPARD綜合征；基因；突變；基因，PTPN11

LEOPARD綜合征（簡稱LS；MIM：151100）是一種少見的遺傳性皮膚病，一般為常染色體顯性遺傳。臨床上以泛發性黑子、心血管受累、發育障礙、耳聾等多系統異常為特征［1］。既往研究已經明確，LS的發病可由PTPN11、RAF1、BRAF等基因突變所致，其中約90%以上的患者由PTPN11突變所致［2-4］。我們收集到一個LS散發家系，對其致病基因PTPN11進行基因突變檢測。

一、病例資料

先證者男，7歲8個月。出生后即發現其臀部及下肢散在數個米粒大小黑色斑疹，未予診治，后漸增多。6個月時發現心臟異常，未予處置。2歲2個月時外院就診，體檢示胸骨左緣2、3肋間II/6級收縮期雜音，P2減低，查心臟彩超示肺動脈瓣及右肺動脈前向血流增快，卵圓孔未閉，肺動脈瓣壓差23.04 mmHg，X線胸片示心胸比0.57，心影增大，心前間隙變窄，未予處置，囑定期復查。3歲時因原發皮損增大、新發皮損增多、且前額出現密集黃豆大小黑色斑疹，于外院皮膚科就診，未予處置。后皮損漸增多增大，累及全身皮膚，密集分布，顏面為主。4歲時家長發現患兒雙側隱睪，于外院手術治療。7歲時發現聽力下降明顯，外院耳鼻喉科隨診。1個月前因心臟癥狀加重于外院行先天性心臟病介入治療（肺動脈瓣球囊擴張成形術），現恢復良好。家族中無類似疾病患者，否認4代內近親婚配史。體檢：發育稍差，聽力減退，心率不齊，未聞及明顯病理性雜音，其余系統檢測無明顯異常。韋氏兒童智力量表評測智商為66，輕度智力低下。皮膚科情況：全身多發直徑1～12 mm黑褐色至黑色斑疹、斑片，面部為主，軀干及四肢可見四處指節大小褐色形狀不規則咖啡斑，邊界清（圖1）。實驗室檢查示血、尿常規、生化、出凝血時間均無異常。

二、方法

圖1 患兒頭頸部皮疹，顏面多發密集雀斑樣黑子

1.DNA的提取：取家系患者、父母及50例健康對照者外周血5 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，使用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技公司生產）提取基因組DNA。

2.引物設計和PCR擴增：采用UCSC網站（http：//genome.ucsc.edu/）查取PTPN11基因mRNA序列，比對得到基因組序列，應用Primer 5.0軟件設計、合成覆蓋PTPN11基因所有外顯子引物（北京擎科新業生物技術有限公司合成），擴增PTPN11全部編碼序列及其側翼序列，其中第7外顯子引物：上游：5′-TTTTTCTGTGACTCTTTGACACG-3′，下游：5′-CACG ACCCTGAGGAAAGGTA-3′。擴增條件：94℃預變性5 min后，94℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 35個循環，72℃后延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。

3.測序：PCR擴增產物經凝膠電泳回收純化，送至北京擎科新業生物技術有限公司測序部測序。

三、結果

所有引物在模板DNA中均擴增出預期長度的片段，產物進行切膠純化后測序，將患者全部外顯子直接測序結果與UCSC網站所公布的序列進行比對，發現患者PTPN11基因第7外顯子上存在一雜合錯義突變c.836A＞G，導致第279位密碼子TAT變為TGT，使正常的酪氨酸變為半胱氨酸，即Y279C。家系中健康者及50例健康對照者均未發現此突變（圖2）。

四、討論

LS是Gorlin等［1］于1969年以其典型臨床特征命名，LEOPARD 系 黑 子 （lentigines）、 心 電 圖 異 常（ECG abnormalities）、眼距過寬（ocular hypertelorism）、肺動脈瓣狹窄（pulmonary stenosis）、生殖器異常（abnormal genitalia）、生長遲緩（retardation of growth）、耳聾（deafness）英文首字母的組合，為常染色體顯性遺傳，既往報道中多為男性。國內于1985年首次報道［5］，我國皮膚科醫師多稱其為多發性黑子綜合征（multiple lentigines syndrome）［6］，此癥不僅累及皮膚，其他系統損害較皮膚表現更為嚴重、甚至致命，我們認為稱之為LS更易提醒醫師診療時注意其他系統損害。

圖2 2A：LS家系患者致病突變PYPN11 c.836A＞G；2B：健康對照者

分子遺傳學研究已明確3個致病基因的突變可導致LS的發病，分別為 PTPN11、RAF1、BRAF［2-4］。其中約 90%的患者由PTPN11突變所致，且所有突變均位于PTPN11的第7、12、13外顯子內，均為錯義突變，而該基因其他外顯子的突變則導致奴南綜合征［2，4，7］。其余 10%的患者由 RAF1［3］、BRAF［4，8］突變導致，報道例數較少。PTPN11 基因編碼一個蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族成員酶——PTPN11。已知PTPN11是調節多種細胞過程的信號分子，包括細胞生長、分化、細胞周期和惡性轉化。PTPN11包含兩個串聯的Src同源區 2結構域（src homology region-2，SH-2），能夠識別蛋白中磷酸化的酪氨酸殘基，目前發現的所有LS致病突變均位于此結構域內。

本研究中患者臨床表現典型，除特殊面容外，具有LS的全部特征性表現，診斷明確。分子生物學研究發現患者PTPN11基因第7外顯子上存在一雜合錯義突變c.836A＞G，導致第279位密碼子TAT變為TGT，使正常的酪氨酸變為半胱氨酸，即Y279C。此突變為國外已多次報道的致病突變［9-10］，提示此位點為一突變熱點位置。該突變及既往發現的所有LS致病突變均位于PYPN11的SH-2結構域內，SH-2的主要功能是介導胞質內多種信號蛋白的相互連接，形成蛋白異聚體復合物，從而調節信號轉導途徑中的信號傳遞。信號蛋白的相互連接是通過的一個多肽分子上SH-2結構域與另一分子磷酸化的酪氨酸殘基直接相互作用而完成的，并通過酪氨酸殘基的磷酸化或去磷酸化而得到調控。通過對該LS家系的基因突變情況研究，發現了該家系的致病突變PYPN 11 c.836A＞G，豐富了漢族人LS的遺傳數據庫。

［1］Gorlin RJ,Anderson RC,Blaw M.Multiple lentigenes syndrome［J］.Am J Dis Child,1969,117（6）：652-662.

［2］DigilioMC,ContiE,SarkozyA,etal.Groupingofmultiple-lentigines/LEOPARD and Noonan syndromes on the PTPN11 gene［J］.Am J Hum Genet,2002,71（2）：389-394.

［3］Pandit B,Sarkozy A,Pennacchio LA,et al.Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy［J］.Nat Genet,2007,39（8）：1007-1012.

［4］Sarkozy A,Carta C,Moretti S,et al.Germline BRAF mutations in Noonan, LEOPARD, and cardiofaciocutaneous syndromes：molecular diversity and associated phenotypic spectrum ［J］.Hum Mutat,2009,30（4）：695-702.

［5］施秀明.多發性黑子綜合征（附一家系報告）［J］.中華皮膚科雜志,1985,18（3）：179-180.

［6］李恒君,陳謹萍.多發性黑子綜合征一例［J］.中華皮膚科雜志,2009,42（7）：507.

［7］Legius E,Schrander-Stumpel C,Schollen E,et al.PTPN11 mutations in LEOPARD syndrome［J］.J Med Genet,2002,39（8）：571-574.

［8］Koudova M,Seemanova E,Zenker M.Novel BRAF mutation in a patient with LEOPARD syndrome and normal intelligence［J］.Eur J Med Genet,2009,52（5）：337-340.

［9］Sarkozy A,Conti E,Digilio MC,et al.Clinical and molecular analysis of 30 patients with multiple lentigines LEOPARD syndrome［J］.J Med Genet,2004,41（5）：e68.

［10］Wang Y,Chen C,Wang DW.Leopard syndrome caused by heterozygous missense mutation of Tyr 279 Cys in the PTPN11 gene in a sporadic case of Chinese Han ［J］.Int J Cardiol,2014,174（3）：e101-e104.

2014-08-14）

（本文編輯：吳曉初）

Mutation analysis of the PTPN11 gene in a family with LEOPARD syndrome

Zang Dongjie*,Xu Xinghai,Zhou Cheng,Zhang Jianzhong,Hou Yanxia,Han Zhuang,Jiang Jing.*Department of Dermatology,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin 300100,China

Jiang Jing,Email：pfkjiangjing@sina.com

ObjectiveTo detect mutations in the PTPN11 gene in a family with LEOPARD syndrome（LS）.MethodsClinical data were collected from a 7-year-old boy patient with LS.Peripheral blood was obtained from the patient,both of his parents,and 50 healthy controls.All the exons and their flanking sequences of the PTPN11 gene were amplified by PCR followed by direct DNA sequencing.ResultsA heterozygous missense mutation c.836A＞G,which resulted in a substitution of TAT by TGT at codon 279,was found in exon 7 of the PTPN11 gene in the patient.No mutation was detected in the unaffected parents or healthy controls.Conclusion The missense mutation c.836A＞G may be the cause of the phenotype of LS in this family.

LEOPARD syndrome;Genes;Mutation;Genes,PTPN11

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.017

300100天津市南開醫院皮膚科（臧東杰、侯艷霞、韓莊、蔣靖）；首都醫科大學附屬北京兒童醫院（許星海）；北京大學人民醫院（周城、張建中）

蔣靖，Email：pfkjiangjing@sina.com