LRP16和E-cadherin在子宮內膜腺癌中的表達研究

劉 玲，詹 平，汪春燕，聶 丹，錢燕萍，毛熙光

(瀘州醫學院附屬醫院婦產科，四川瀘州646000)

LRP16基因是ER信號通路上的應答基因，其 表達依賴雌激素，可作為雌激素調控細胞功能或形態特點的中間信號因子［1］，其高表達增強了子宮內膜癌細胞的侵襲轉移能力，說明LRP16基因可能促進子宮內膜癌的侵襲轉移［2］。E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)與E2信號通路有關，是ER直接作用的靶基因［3］。研究發現LRP16過表達Ishikawa細胞中E-鈣黏著素基因的蛋白水平顯著下調，由此推測LRP16通過下調E-鈣黏著素水平增加其侵襲能力［4］。子宮內膜癌組織中LRP16蛋白的表達情況及其與E-cadherin之間的調控關系尚不清楚，為近一步證實LRP16對子宮內膜癌發生發展可能的作用，本研究采用免疫組化方法檢測比較子宮內膜腺癌組織中LRP16表達情況，分析子宮內膜腺癌中LRP16蛋白與臨床病理特征及與E-cadherin表達的關系，以探討兩者在子宮內膜腺癌病理進程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2009年10月至2011年3月在瀘州醫學院附屬醫院因子宮內膜癌行手術治療患者的病理標本共60例(其中高分化腺癌18例、中分化腺癌26例、低分化腺癌16例)。根據2009FIGO子宮內膜癌手術病理分期，Ⅰ期24例，Ⅱ期20例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例。術前均未接受放、化療和激素治療。平均年齡(54．52±5．79)歲。正常子宮內膜組織來源于同期因子宮肌瘤行子宮全切除術標本共20例，術后病理學證實子宮內膜無惡性病變及其他病變存在，平均年齡(51．04 ±5．57)歲。

1.2 方法

所有新鮮標本均經10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4μm切片。兔抗人多克隆的LRP16抗體、鼠抗人單克隆E-cadherin抗體和SP-9001試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。兩種抗原均行微波修復，按試劑盒說明書操作，蘇木素復染。用已知的陽性片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。均采用采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法(SP)染色。

1.3 結果判斷

LRP16陽性結果判斷:評分標準參照田麗媛等報道的方法［5］。LRP16核內、胞漿內著色分別記錄。每張切片低倍鏡下選取典型腫瘤部位，高倍鏡(放大400倍)下觀察并拍攝，計數1 000個腫瘤細胞，陽性細胞數量和著色強度分別記錄并進行量化處理，結果判定由病理科兩位醫師分別測定并統計。(1)著色強度按下列標準評分:無色(陰性)0分，淡棕黃色(弱陽性)1分，棕黃色(陽性)2分，棕褐色(強陽性)3分。(2)陽性細胞數量按下列標準評分:無陽性細胞記為0分，＜30% 為1分，30%～60%為2分，＞60%為3分;(3)上述兩者評分之和，0-1分者為(-);2分為(+);3-4分為(++);5-6分為(+++)。E-cadherin陽性結果判斷:評分標準參照Birner法［6］。由兩名病理學專家雙盲法觀察切片，若兩專家結果不一致，重新判定。染色結果以半定量方法進行判定，根據染色的強度和范圍評分。先按染色強度評分:1分:表達缺失或染色弱;2分;中等強度染色;3分:強染色。再按陽性細胞數的百分比進行評分:1分:陽性細胞數＜10%;2分:陽性細胞數10%～50%;3分陽性細胞數51%～80%;4分:陽性細胞數＞80%。兩項評分相乘所得的積分為得分:不管其染色強度，只要陽性細胞數＜10%者為(-);3分為(+);4～5分為(++);6～7分為(+++)。表達陽性率=根據評分判為(+)例數/總例數×100%

1.4 統計學處理

應用SPSS17．0軟件包進行統計分析，兩組間比較采用 Mam-Whitneyu U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關檢驗，P＜0．05為有統計學意義。

2 結果

2.1 LRP16在子宮內膜腺癌中的表達

LRP16表達于細胞核或細胞漿，呈淺黃色或棕褐色，在肌層及血管中未見表達(見圖1)。LRP16在各組中的表達情況見表1。Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期子宮內膜腺癌組織中，LRP16細胞漿和細胞核表達均高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05);子宮內膜腺癌G1、G2、G3級組織中LRP16漿和核表達均高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05)。對LRP16表達強度評分與組織學分級進行相關分析，發現LRP16核表達與組織學分級呈正相關(r=0．465，P=0．00)，而與手術病理分期無相關性(r=-0．233，P=0．073);LRP16 漿表達與手術病理分期呈負相關(r=-0．33，P=0．01)，而與組織學分級無相關性(r=-0．067，P=0．61)。

2.2 E-cadherin在子宮內膜癌中的表達

圖1 子宮內膜癌組織中LRP16表達情況

表1 細胞內不同部位LRP16蛋白的表達與臨床病理特征

E-cadherin完全表達于子宮內膜組織的腺上皮細胞細胞膜，呈棕黃(褐)色，呈線性分布(見圖2～4)。E-cadherin在各組中的表達情況見表2。子宮內膜腺癌組中E-cadherin的陽性表達率為86．67%，而正常組中為90．00%，二者差異無統計學意義(P＞0．05)。Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期子宮內膜腺癌組織中，E-cadherin表達均低于對照組，差異無統計學意義(P＞0．05);子宮內膜腺癌 G1組織中E-cadherin表達低于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05);G2組織中E-cadherin表達高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05);而G3組織中其表達高于對照組，差異無統計學意義(P＞0．05)。對E-cadherin表達強度評分與組織學分級進行相關分析發現，E-cadherin的表達與組織學分級無相關性(r=-0．033，P=0．804)，E-cadherin 的表達與手術病理分期無相關性(r=0．107，P=0．417)。

圖4 E-cadherin在子宮內膜癌G3組織中的表達(SP×200)

表2 不同分化程度的子宮內膜腺癌中E-cadherin的陽性表達情況(例)

2.3 LRP16與E-cadherin在子宮內膜腺癌中表達的相關性

對60例子宮內膜腺癌LRP16與E-cadherin的表達進行等級相關分析發現，子宮內膜腺癌胞核中LRP16表達和E-cadherin的表達差異無明顯相關性(P＞0．05)，胞漿中 LRP16表達和E-cadherin的表達差異無明顯相關性(P＞0．05)。(見表3)。

表3 LRP16在細胞不同部位著色強度與E-cadherin關系

3 討論

3.1 LRP16表達與子宮內膜癌的關系

研究發現LRP16在多種惡性腫瘤中表達，且表達水平與腫瘤組織學分級及臨床分期相關，而目前LRP16在腫瘤的侵襲和轉移中的作用尚不甚明確。臧麗等［7］研究發現LRP16在乳腺癌中的表達與腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移、臨床分期、ER表達呈正相關。梁朝陽等［8］研究顯示，LRP16基因在肺腺癌與肺鱗癌組織中呈過表達，且在有淋巴結轉移組呈過表達，與肺癌的分期相關。田麗媛等［5］研究表明LRP16在癌細胞漿和胞核內均有分布，LRP16在核內的表達強度與漿液性卵巢癌臨床分期的高低呈正相關。陳美霞［9］等研究發現LRP16在子宮內膜腺癌細胞中均有表達，其在胞漿中的表達與手術病理分期呈明顯負相關，LRP16在胞漿中的表達可能提示預后良好。劉佳等［10］研究發現LRP16 mRNA在子宮內膜癌組織中存在表達缺失或低表達，其陽性表達率與組織學分級、手術-病理分期及子宮肌層浸潤深度均有關。

本課題前期研究發現子宮內膜癌組織中LRP16 mRNA的表達明顯高于正常子宮內膜組織，且LRP16蛋白產物核表達水平與癌細胞的分化程度呈負相關［11］。本研究顯示LRP16表達于胞核或胞漿，呈淺黃色或棕褐色，在肌層及血管中未見表達，由此推測LRP16可能并不直接參與子宮內膜癌局部侵襲轉移及遠處血行轉移，其參與子宮內膜癌的發生發展過程可能有需其他信號途徑的協同參與。本研究亦發現Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期子宮內膜腺癌組織中，LRP16漿和核表達均高于對照組，子宮內膜腺癌G1、G2、G3組織中LRP16漿和核表達均高于對照組，與本課題前期結果相一致［11］。同時，研究顯示LRP16核表達與組織學分級呈正相關，而與手術病理分期無相關性;LRP16漿表達與患者的手術病理分期呈負相關，而與組織學分級無相關性，由此推測可能LRP16核表達提示預后不良，LRP16漿表達提示預后良好，可能LRP16在組織細胞的不同部位表達存在某種反饋調節機制，發揮惡性轉變及保護作用的雙重調節。由此我們推測LRP16在子宮內膜癌的發生和發展中發揮重要作用，可能與子宮內膜癌的侵襲、轉移和預后相關。

3.2 E-cadherin與子宮內膜癌的關系

E-cadherin是一種Ca2+依賴性細胞黏附分子，其結構和功能的變化通過影響細胞的脫落與再附著而直接關系到細胞的生物學行為的改變，表達下降或基因突變等使E-cadherin粘附系統紊亂，導致E-cadherin功能降低，可降低細胞間的粘附作用［12-13］，研究發現子宮內膜癌組織中存在E-cadherin的表達降低現象［14］，E-cadherin作為參與細胞間粘附作用的重要粘附分子，它的表達下降與子宮內膜癌細胞間的粘附力下降密切相關，可能參與子宮內膜癌細胞的浸潤轉移過程。本研究結果顯示E-cadherin定位于細胞一細胞交界處，呈線性、均勻一致，E-cadherin可能與上皮細胞間粘附的功能有關。本研究亦發現Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期子宮內膜腺癌組織E-cadherin表達均低于對照組，子宮內膜腺癌G1組織中E-cadherin表達低于對照組，而G2、G3組織中E-cadherin表達高于對照組;但E-cadherin的表達與子宮內膜癌病理分級及分期無相關性，與Feng［14］的研究結果不一致，可能因選擇的病例選擇樣本量小、病例臨床病理因素構成比不同，導致統計分析的結果存在偏差。因此，進行大樣本的E-cadherin表達與子宮內膜癌臨床病理因素的聯系的分析可能有助于得出較為肯定性的結論。

3.3 LRP16與E-cadherin在子宮內膜癌中的關系

目前越來越多研究致力于探討LRP16對腫瘤侵襲轉移的影響。韓為東等從細胞水平闡明LRP16基因通過下調E-cadherin的表達促進腫瘤侵襲轉移，LRP16在乳腺癌組織中的表達與E-cadherin表達呈負相關［15］，本研究對60例子宮內膜腺癌中LRP16與E-cadherin的表達情況分析，LRP16與E-cadherin表達間未顯示出相關性，基于子宮內膜癌Ishikawa細胞系中的研究結論在組織中沒有得到證實，可能由于免疫組化方法對分析蛋白間的關系缺乏靈敏性。因此LRP16與E-cadherin在子宮內膜癌侵襲和轉移中的作用還需要深入研究。

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