活絡通口服液質量標準的研究

蔡玉榮戴慧賢童惠貞▲李 華歐國燈王 虹袁惠霞

1.廣東太陽神集團有限公司，廣東廣州 510665；2.廣東省食品藥品檢驗所，廣東廣州 510180；3.廣東省廣州荔灣區中醫醫院，廣東廣州 510140

活絡通口服液質量標準的研究

蔡玉榮1戴慧賢2童惠貞2▲李 華2歐國燈2王 虹1袁惠霞3

1.廣東太陽神集團有限公司，廣東廣州 510665；2.廣東省食品藥品檢驗所，廣東廣州 510180；3.廣東省廣州荔灣區中醫醫院，廣東廣州 510140

目的 完善活絡通口服液的質量標準。 方法 采用薄層色譜法對制劑中天山雪蓮、肉蓯蓉、西洋參、何首烏與澤瀉進行定性鑒別；高效液相色譜法測定天山雪蓮與槐花中蘆丁的含量以及葛根中葛根素的含量。結果 薄層色譜鑒別的色譜斑點清晰，陰性對照無干擾；蘆丁的加樣回收率為98.2%，RSD為2.0%（n=9），線性范圍為0.0098～0.4486mg/mL（r=1）；葛根素的加樣回收率為96.5%，RSD為0.6%（n=9），線性范圍為0.0075～0.4223mg/mL（r=1）。 結論 所建立的方法簡便、準確、重復性好，專屬性強，可用于活絡通口服液的質量控制。

活絡通口服液；質量標準；薄層色譜；高效液相色譜

活絡通口服液是由天山雪蓮、肉蓯蓉、何首烏、決明子等十六味藥組成的制劑，具有益氣補腎，活血通絡的作用。原標準為國家食品藥品監督管理局試行標準，標準編號為WS-5737-（B-0737）-2002。原標準包括了天山雪蓮花、西洋參、何首烏、山楂、決明子、槐花與肉蓯蓉的TLC鑒別，以及葛根素的含量測定。對原質量標準進行驗證，結果該標準除西洋參的TLC鑒別及葛根的含量測定基本可以重現外，其他的薄層色譜鑒別重現性較差，均需要修訂。新標準修訂了天山雪蓮、肉蓯蓉、西洋參與何首烏的TLC鑒別；擬刪去專屬性不強的山楂、決明子的TLC鑒別；槐花藥味已有含量測定控制，擬刪去槐花的TLC鑒別；新增澤瀉的TLC鑒別，經方法學驗證，斑點清晰，方法可行，擬列入標準正文。同時對牛膝、浦黃、益母草的TLC鑒別進行了研究，由于方法不可行，有待進一步研究，暫不列入標準正文。并修訂了葛根的含量測定，增加了天山雪蓮及槐花的含量測定。新建立的質量標準，定性、定量方法均簡便、準確、專屬性強，可以有效地控制本品的質量。

1 儀器與試藥

GAMAG REPROSTAR 3薄層數碼成像系統；GAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4全自動點樣儀；安捷倫1260、1100高效液相色譜儀，G1315B型二級陣列檢測器DAD；島津SHIMADIU-20A高效液相色譜儀；天平Sartoriu CP224S、CP225D；色譜柱：Shim-pack CLC-ODS-C18（150mm×4.6mm，5μm）。天山雪蓮對照藥材（批號：121205-0101）、松果菊苷（批號：111670-200503）、西洋參對照藥材（批號：120997-200608）、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：110844-200607）、澤瀉對照藥材（批號：1081-9901）、蘆丁對照品（批號：100080-200707，含量90.5%）、葛根素對照品（批號：110752-200912，含量96.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院?；罱j通口服液樣品（批號分別為T1206001、T1209001與T1210001）與各陰性對照樣品，均由廣東太陽神集團有限公司按處方比例及工藝制備及提供。甲醇（色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 天山雪蓮的薄層色譜鑒別

供試品溶液的制備：取本品30mL，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，即得。

對照藥材溶液的制備：取天山雪蓮對照藥材1g，加水30mL，加熱回流1h，濾過，濾液自“加三氯甲烷振搖提取3次”起，同供試品溶液的的制備方法制備，即得。

陰性溶液的制備：取天山雪蓮陰性對照樣品30mL，同供試品溶液的制備方法制備，即得。

點樣量：10μL。

薄層板：硅膠G薄層板。展開劑：二氯甲烷-甲醇-甲酸（18∶2∶0.5）。顯色方法：噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在日光下檢視。

結果：供試品具對照藥材特征斑點，陰性對照無干擾。見圖1。

2.2 肉蓯蓉的薄層色譜鑒別

供試品溶液的制備：取本品10mL，通過已處理好的聚酰胺柱（14～30目，4g，柱內徑為1.5cm），用水35mL洗脫，棄去洗脫液，再依次用20%乙醇、40%乙醇與70%乙醇溶液各25mL洗脫，收集20%乙醇和70%乙醇（備用）洗脫液，將20%乙醇洗脫液蒸干，殘渣加甲醇lmL使溶解，即得。

對照品溶液的制備：取松果菊苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，即得。

陰性溶液的制備：取肉蓯蓉陰性對照樣品10mL，同供試品溶液的制備方法制備，即得。

點樣量：供試品溶液與陰性對照溶液各8μL、對照品溶液2μL。

薄層板：聚酰胺薄膜。

展開劑：甲醇-冰醋酸-水 （2∶0.7∶7）。

顯色方法：噴以0.2%三氯化鐵乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，在日光下檢視[1]。

結果：供試品色譜中，在與松果菊果對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

2.3 西洋參的薄層色譜鑒別

供試品溶液的制備：取本品30mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20mL，加水洗至中性，正丁醇提取液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，即得。

對照藥材溶液的制備：西洋參對照藥材1g，加甲醇20mL，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30mL使溶解，自“加水飽和的正丁醇振搖提取3次”起，同供試品溶液的制備方法制備，即得。

陰性溶液的制備：取西洋參陰性對照樣品30mL，同供試品溶液的制備方法制備，即得。

點樣量：2μL。

薄層板：硅膠G薄層板。

展開劑：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2.5∶0.5）。

展距：15cm。

顯色方法：噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別在日光和紫外光（365nm）下檢視。

結果：供試品具對照藥材特征斑點，陰性對照無干擾。見圖3。

2.4 何首烏的薄層色譜鑒別

供試品溶液的制備：取肉蓯蓉[鑒別]項下的備用70%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，即得[2]。

對照品溶液的制備：取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，即得。

陰性溶液的制備：取何首烏陰性對照樣品30mL，同供試品溶液的制備方法制備，即得。

點樣量：2μL。

薄層板：硅膠G薄層板。

展開劑：乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸（15∶0.7∶0.5）。

顯色方法：在紫外光（365nm）下檢視。

結果：供試品色譜中，在與2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖4。

2.5 澤瀉的薄層色譜鑒別

供試品溶液的制備：取本品50mL，置250mL錐形瓶中，用石油醚（60～90℃）50mL，加熱回流30min，放冷，分取石油醚（60～90℃）層，蒸至近干，殘渣加石油醚（60～90℃）1mL使溶解，即得。

對照藥材溶液的制備：取澤瀉對照藥材1g，加水50mL，加熱回流30min，放冷，濾過，濾液自“加石油醚（60～90℃）50mL”起，同法制成對照藥材溶液。

陰性溶液的制備：取澤瀉陰性對照樣品30mL，同供試品溶液的制備方法制備，即得。

點樣量：供試品溶液10μL、對照藥材溶液5μL。

薄層板：硅膠G薄層板。

展開劑：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶7∶1）。

顯色方法：噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光（365nm）下檢視[3]。

結果：供試品具對照藥材特征斑點，陰性對照無干擾。見圖5。

圖1 天山雪蓮薄層色譜鑒別圖

圖2 肉蓯蓉薄層色譜鑒別圖

圖3 西洋參薄層色譜鑒別圖

圖4 何首烏薄層色譜鑒別圖

圖5 澤瀉薄層色譜鑒別圖

3 含量測定

3.1 蘆丁的含量測定

3.1.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack CLC-ODS-C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇-1%冰醋酸溶液（35∶65）[4]；檢測波長為257nm；體積流量：1mL/min；理論板數按蘆丁峰計算應不低于2000。

3.1.2 溶液的制備 對照品：取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。供試品：精密量取本品5mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。陰性對照：取天山雪蓮與蘆丁雙陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

3.1.3 線性關系考察 精密吸取蘆丁系列對照品溶液（濃度分別為0.4486、0.2243、0.0980、0.0490、0.0245、0.0098mg/mL）各10μL，注入液相色譜儀，按上述條件測定峰面積，以峰面積為為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得回歸方程：y=21704080.0283x+4065.6431，r=1.0000，結果表明，蘆丁在0.0098～0.4486mg/mL的范圍內線性關系良好。

3.1.4 儀器精密度考察 精密吸取蘆丁對照品溶液，按上述條件連續進樣6次，測定峰面積，結果蘆丁峰面積的RSD為0.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.1.5 穩定性考察 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別在0、4、9、13、17、21、26h精密吸取10μL注入液相色譜儀，測定其峰面積，結果蘆丁峰面積RSD為0.1%（n=7），表明供試品溶液中蘆丁在26h內基本穩定。

3.1.6 重復性考察 取同一批樣品（批號T1206001），取6份，每份精密量取5mL，按擬定的方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件測定，結果重復性為0.6%，說明本方法重復性良好。

3.1.7 加樣回收率試驗 精密稱取蘆丁對照品0.04957g（含量90.5%），置50mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（即：每1mL含蘆丁0.897217mg），作為回收用對照品溶液。取同一批樣品（批號T1206001，含蘆丁為0.87940mg/mL）9份，分為高中低濃度3組，每組各取3份，高中低濃度組分別精密量取1、2.5、5mL，分別置100mL量瓶中。分別加入相應的回收用對照品溶液，高中低濃度組分別精密加入回收用對照品溶液1、2.5、5mL，加水稀釋至刻度，搖勻，即可。按含量測定方法測定，計算蘆丁的回收率，平均回收率蘆丁為98.2%，RSD為2.0%（n=9），說明該方法的準確度良好。見表1。

3.1.8 專屬性考察 按供試品溶液的制備方法同法制成天山雪蓮、槐花雙陰性對照溶液，分別吸對照品溶液、供試品溶液與天山雪蓮、槐花雙陰對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，結果天山雪蓮槐花雙陰性對照無干擾。見圖6。

表1 蘆丁準確度（加樣回收）試驗結果

圖6 蘆丁液相色譜圖

3.1.9 樣品的測定 取活絡通口服液3批，照擬定的含量測定方法測定蘆丁含量，見表2。

3.2 葛根素的含量測定

3.2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack CLC-ODS-C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇-水（22∶78）；檢測波長為250nm；體積流量：1mL/min；理論板數按葛根素峰計算應不低于2500。

表2 樣品含量測定結果（蘆?。?/p>

3.2.2 溶液的制備 對照品：取葛根素對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成每1mL含30μg的溶液，即得。供試品：精密量取本品5mL，通過已處理好的中性氧化鋁柱（100～200目，5g，柱內徑為1cm，用30%乙醇溶液10mL預洗），用30%乙醇溶液50mL洗脫，收集洗脫液，置水浴上濃縮至約2mL，用30%乙醇溶液溶解并轉移至10mL量瓶中，加30%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。陰性對照：取葛根陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

3.2.3 線性關系考察 精密吸取葛根素系列對照品溶液（濃度分別為0.4223、0.2534、0.1013、0.0302、0.0151、0.0075mg/mL）各10μL，注入液相色譜儀，按上述條件測定峰面積，以峰面積為為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得回歸方程：y=44883x-10.956，r=1.0000 ，結果表明，葛根素在0.0075～0.4223mg/mL的范圍內線性關系良好。

3.2.4 儀器精密度考察 精密吸取葛根素對照品溶液，按上述條件連續進樣6次，測定峰面積，結果葛根素峰面積的RSD為0.1%（n=6）。表明儀器精密度良好。

3.2.5 穩定性考察 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別在0、4、8、15、21、26h精密吸取10μL注入液相色譜儀，測定其峰面積，結果葛根素峰面積RSD為0.3%（n=6），表明供試品溶液中葛根素在26h內基本穩定。

3.2.6 重復性考察 取同一批樣品（批號T1206001），取6份，每份精密量取5mL，按擬定的方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件測定，結果重復性為1.9%，說明本方法重復性良好。

3.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取葛根素對照品0.01571g（含量96.0%），置25mL量瓶中，加30%乙醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（即：每1mL含葛根素0.603264mg），作為回收用對照品溶液母液。精密量取回收用對照品溶液母液5mL置50mL量瓶中，加30%乙醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（即：每1mL含葛根素0.0603264mg）。精密量取同一批樣品（批號T1206001，含葛根素為0.06628mg/mL）9份，分為高中低濃度3組，每組各取3份，高中低濃度組分別精密量取1、2.5、5mL，加在已處理好的中性氧化鋁柱（100～200目，5g，柱內徑為1cm，先以10mL 30%乙醇溶液預洗）上。分別加入相應的回收用對照品溶液，高中低濃度組分別精密加入回收用對照品溶液1、2.5、5mL，用30%乙醇50mL洗脫，收集流出液及洗脫液，置水浴上濃縮至約2mL，并轉移至10mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即可。計算葛根素的回收率，平均回收率葛根素為96.5%，RSD為1.2%（n=9），說明該方法的準確度良好。見表3。

3.2.8 專屬性考察 按供試品溶液的制備方法同法制成葛根陰性對照溶液，分別吸對照品溶液、供試品溶液與葛根陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，結果葛根陰性對照無干擾。見圖7。

3.2.9 樣品的測定 取活絡通口服液3批，照擬定的含量測定方法測定葛根素含量，見表4。

表3 葛根素準確度（加樣回收）試驗結果

圖7 葛根液相色譜圖

表4 樣品含量測定結果（葛根素）

4 討論

處方中天山雪蓮為君藥，目前關于天山雪蓮薄層色譜鑒別研究的相關文獻報導較少，且多以蘆丁與綠原酸為對照[5-6]，專屬性差，本文采取天山雪蓮對照藥材為對照建立天山雪蓮的薄層色譜鑒別，專屬性強，可用于該制劑中天山雪蓮的薄層色譜鑒別。

肉蓯蓉薄層色譜鑒別，分別參考相關文獻[7-9]對樣品中的肉蓯蓉進行薄層色譜鑒別研究，通過比較分析，供試品通過聚酰胺柱后，先以水35mL洗脫，將糖類等極性較大的成份除去，再以20%乙醇洗脫，收集洗脫液，這樣得出的供試品溶液雜質相對較少，而待測成份松果菊苷含量相對較高。顯色方法，直接置紫外光（365nm）下檢視，主斑點容易受到其它斑點的干擾，因此采用0.2%三氯化鐵乙醇溶液顯色，主斑點清晰，不受其它斑點的干擾。

西洋參薄層色譜鑒別，西洋參的主要成份為皂苷類，參考相關文獻[10-11]中所使用的皂苷類成分展開劑，通過比較及調整展開劑的比例，最后以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2.5∶0.5）為展開劑展開的效果最好，因此選用了該展開劑。

何首烏薄層色譜鑒別，原標準為鑒別何首烏中大黃素和大黃素甲醚成分，專屬性差，現修訂為鑒別何首烏中專屬性較強的2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷成分[12]。修訂后的薄層色譜鑒別方法，經方法學驗證，斑點清晰，陰性對照無干擾，認為該方法基本可行。

分別對天山雪蓮、肉蓯蓉、西洋參、何首烏與澤瀉的薄層色譜鑒別方法進行方法學驗證試驗，結果表明方法的耐用性較好。對牛膝、浦黃和益母草的薄層色譜鑒別進行了研究，由于方法不可行，有待進一步研究，暫不列入標準正文。天山雪蓮收載中國藥典《中國藥典》2010年版一部（P50），含量測定項以蘆丁與綠原酸為指標?；被ㄊ蛰d中國藥典《中國藥典》2010年版一部（P333），含量測定項以蘆丁為指標。相關文獻報導，蘆丁具有抗菌消炎、抗輻射、調節毛細血管壁的滲透及脆性、防止血管破裂、止血和對紫外線具有極強的吸收以及很好的抗氧化等作用[13]，因此增訂了以蘆丁為指標的含量測定項。葛根素的含量測定項，原標準以丙酮為提取溶劑，對樣品的中葛根素進行提取與凈化，考慮到丙酮毒性較大，而且該方法對供試品溶液并不能起到很好的凈化作用，因而進行了修訂。新修訂的方法是將樣品直接通過中性氧化鋁柱進行凈化，凈化效里較為理想，且采用的洗脫溶劑為30%乙醇，毒性較低。

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Quality standard research of huoluotong oral liquid

CAI Yurong1DAI Huixian2TONG Huizhen2LI Hua2OU Guodeng2WANG Hong1YUAN Huixia3
1.Guangdong Apollo Group CO.,LTD,Guangzhou 510665,China;2.Guangdong Institute for Food and Drug Control,Guangzhou 510180,China;3.Taditional Chinese Medicine of Liwan District Hospital of Guangdong Provine,Guangzhou 510140,China

Objective To improve the quality standard for HuoluoTong oral liquid. Methods The method of TLC was used to qualitatively identify Saussureae Involucratae Herba,Cistanches Herba,Panacis Quinquefolii Radix,Polygoni Multiflori Radix and Alismatis Rhizoma.The content of Rutin in Saussureae Involucratae Herba and Sophorae Flos and the content of Puerarin in Puerariae Lobatae Radix was determined by HPLC. Results All herbal drugs in Huoluotong oral liquid were well identified by TLC and spots were clear and without interference.The average recovery rate of Rutin was 98.2% with RSD 2.0%(n=9).The linear of Rutin was 0.0098-0.4486mg/mL(r=1).The average recovery rate of Puerarin was 96.5% with RSD 0.6%(n=9).The linear of Puerarin was 0.0075-0.4223mg/mL(r=1). Conclusion The method is simple, accurate,good reproducibility and specificity.It could be used in the quality control of HuoluoTong oral liquid.

Huoluotong oral liquid;Quality standard;Thin-layer chromatography;High performance liquid chromatography

R286

A

2095-0616（2015）07-50-06

2015-01-25）

▲通訊作者