生物制品用內包材微生物限度檢測方法的驗證

牛曉霞 崔艷文 吳美英

北京三元基因工程有限公司，北京102600

生物制品用內包材微生物限度檢測方法的驗證

牛曉霞 崔艷文 吳美英▲

北京三元基因工程有限公司，北京102600

目的 建立生物制品用內包材（中性硼硅玻璃管制注射劑瓶﹑藥用鹵化丁基橡膠塞和抗生素瓶用鋁塑組合蓋）微生物限度檢查方法，并進行驗證。 方法 采用薄膜過濾法檢查上述3種內包材的微生物限度，并按照驗證試驗方法，在供試品中加入5種標準菌，測定其回收率。 結果 金黃色葡萄球菌﹑銅綠假單胞菌﹑枯草芽孢桿菌﹑白色念珠菌和黑曲霉5種標準菌在上述3種內包材供試品溶液中的平均回收率均為70%～110%，符合公示的2015年版藥典中要求的50%～200%的標準。 結論 薄膜過濾法適用于上述3種內包材的微生物限度檢驗。

內包材；微生物限度；驗證

生物制品用內包材包括中性硼硅玻璃管制注射劑瓶（下稱西林瓶）﹑藥用鹵化丁基橡膠塞（下稱膠塞）和抗生素瓶用鋁塑組合蓋（下稱鋁塑蓋），已廣泛應用到無菌制劑生產領域[1-3]，它們的質量直接關系到藥品的安全[4]。其微生物負載量是藥品生產環節環境微生物污染的主要來源之一，也成為近年來藥品生產污染控制的主要關注點。微生物限度檢查法是檢查非無菌制劑和物料微生物負載的方法[5]。

微生物檢查結果易受各種試驗條件的影響，包括抑制微生物生長的成分﹑微生物回收率等。因此，任何樣品在建立微生物限度檢查法時均需驗證，確保試驗結果的準確性[6-8]。

2015年版《中國藥典》對非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法進行了較大幅度的修訂，修訂后的中國藥典微生物限度檢測系統與國外完全一致[9]。本文按照2015年版《中國藥典》的要求，采用薄膜過濾法對生物制品用內包材進行微生物限度檢查，建立了適用于該物料的微生物限度檢查法并進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器

Labonce-250BI生化培養箱（北京蘭貝石恒溫技術有限公司），HFsafe-1200LC生物安全柜（力新儀器上海有限公司），SQ810C立式壓力蒸汽滅菌器（YAMATO），KYC-100C恒溫培養搖床（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.2 標準菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]﹑銅綠假單孢菌[CMCC（B）10104]﹑枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]﹑白色念珠菌[CMCC（F）98001]和黑曲霉[CMCC（F）98003]均來自中國醫學微生物菌株保藏管理中心。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）﹑胰酪大豆胨液體培養基（TSB）﹑沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）﹑沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）和蛋白胨水培養基等均購自北京三藥科技開發公司。

1.4 供試液的制備

用無菌方法操作，取西林瓶或鋁塑蓋100個浸泡于2000mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中30min，充分震蕩后倒出溶液即為供試液。

用無菌方法操作，取膠塞100個浸泡于500mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中30min，充分震蕩后倒出溶液即為供試液。

1.5 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌﹑銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種至TSB培養基中，30～35℃培養18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成50～100CFU/mL的菌液。

將白色念珠菌的新鮮培養物接種至SDB培養基中，20～25℃培養2～3d，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成50～100CFU/mL的菌液。

將黑曲霉的新鮮培養物接種至SDA斜面培養基上，20～25℃培養5～7d，直至獲得豐富孢子。加入3～5mL無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，過濾掉菌絲后，用0.9%無菌氯化鈉溶液將其稀釋成50～100CFU/mL的孢子懸液。

1.6 微生物限度檢查

取西林瓶或鋁塑蓋的供試液，采用薄膜過濾法[9]，需氧菌總數計數用濾膜每張過濾100mL供試液，霉菌酵母菌總數計數用濾膜每張過濾500mL供試液（每次100mL，過濾5次），每種計數做兩個平行。將前兩張濾膜轉移至TSA培養基上，30～35℃培養3d；后兩張濾膜轉移至SDA培養基上，20～25℃培養5d，觀察結果。

取膠塞的供試液，采用薄膜過濾法，每張濾膜過濾100mL供試液，濾膜轉移﹑培養及觀察與上述西林瓶和鋁塑蓋相同。

1.7 方法學驗證

進行3次獨立的平行試驗，分別計算各標準菌株的回收率。

1.7.1 試驗組 取上述1.6規定條件的供試液過濾，并在最后一次過濾時加入1mL菌液，在規定條件下培養，計數。

1.7.2 菌液組 取1mL菌液，加入到100mL無菌氯化鈉溶液中，采用薄膜過濾法，測定所加試驗菌菌數。

1.7.3 供試品對照組 按照1.6規定的方法，測定供試液中菌數。

1.7.4 回收率計算 回收率（%）=（試驗組的菌數-供試品對照組菌數）/菌液組菌數×100%。判定標準：3次平行的試驗中，5種標準菌的回收率均為50%～200%，判定為合格。

2 結果

用薄膜過濾法3次檢測3種內包材的微生物限度，標準菌株的回收率均為70%～110%，結果判定為合格，表1～5。

表1 金黃色葡萄球菌的回收率（%）

表2 銅綠假單胞菌的回收率（%）

表3 枯草芽孢桿菌的回收率（%）

表4 白色念珠菌的回收率（%）

表5 黑曲霉的回收率（%）

3 討論

近年來，藥品內包材微生物負載量越來越受到關注[7-8]。在生物制品生產過程中，使用的物料均需要進行微生物限度檢查，確保符合使用要求。并且能更科學和合理的制定物料處理工藝，如內包材清洗滅菌程序等[10]。

本實驗用薄膜過濾法分別建立了西林瓶，膠塞和鋁塑蓋3種內包材的微生物限度檢查方法，并進行驗證。在3次獨立的試驗中，金黃色葡萄球菌﹑銅綠假單胞菌﹑枯草芽孢桿菌﹑白色念珠菌和黑曲霉5種標準菌株的回收率均為70%～110%，符合2015年版《中國藥典》50%～200%的要求，同時也符合USP﹑EP和JP的要求。

微生物限度檢查不同于其他理化檢驗項目，其檢驗周期長，影響因素多，在實際操作中，經常出現各種誤差[11]。在建立新的方法時，除了需要系統的驗證，還需要摸索和細化各個試驗條件[12]。檢驗人員的經驗﹑過程的控制﹑物料的選擇﹑標準菌株的管理和培養基等都對試驗結果有不同程度的影響。

[1] 黃立新，朱蓮，陳卓，等.中性硼硅西林瓶在甲型肝炎疫苗生產中的應用[J].國際流行病學傳染病雜志，2013，40（2）：139-140.

[2] 趙霞，胡昌琴，金少鴻.藥用膠塞及其應用現狀[J].中國藥事，2006，20（7）：433-436.

[3] 辛繼國.鋁塑復合蓋臭氧消毒應用分析[J].南北橋，2009，3：126.

[4] 郭麗.關于藥品內包材質量對于藥品質量影響的探討[J].中國科技縱橫，2007，7：207.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄98-108.

[6] 陳波，徐程林，劉桂芳，等.生物制品用原輔料微生物限度檢測方法的驗證[J].中國生物制品學雜志，2009，22（5）：498-500.

[7] 黃依玲.明膠空心膠囊微生物限度檢查法的建立和驗證[J].廣西醫科大學學報，2013，30（4）：641-643.

[8] 羅書香，周顯飛，劉輝，等.口服液體藥用聚酯瓶微生物限度檢查方法的探討[J].中國藥師，2014，17（1）：176-177.

[9] 國家藥典委員會.1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法征求意見稿[R].

[10] 王萍.對新版GMP下鋁塑復合蓋滅菌處理方式及設備的探討[J].機電信息，2010，17：19-22.

[11] 劉金鳳.分析藥品微生物限度檢驗誤差影響因素[J].食品與藥品檢驗，2014，24（2）：188-189.

[12] 朱亞虹，黃凱，曾環想.藥品微生物檢測的質量保證[J].中國醫藥指南，2010，8（33）：176.

Verification of method for microbial limit test on inner packing material of biologics

NIU Xiaoxia CUI Yanwen WU Meiying
Beijing Triprime Genetic Engineering Co.,Ltd, Beijing 102600, China

Objective To develop and verify a method for microbial limit test on inner packing material of biologics. Methods The microbial limits of 3 kinds of inner packing material of biologics, i.e. vial, rubber closures and aluminum-plastic combination cover, were tested by membrane filtration method, and the developed method was verified by adding standard microorganisms with known counts into the test samples and determining their recovery rates. Results All the recovery rates of standard Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans and Aspergillus niger in the test samples of 3 kinds of inner packing material were 70%～110%, which met the requirements(50%～200%) in Chinese Pharmacopoeia(Draft of the 2015 edition). Conclusion The developed membrane filtration method was suitable for above-mentioned 3 kinds of inner packing material.

Inner packing material; Microbial limit; Verification

Q939.9

B

2095-0616（2015）16-201-03

2015-03-12）

▲通訊作者