紫貽貝貝殼和脈紅螺厴中色素的提取與鑒定

郝世鑫 , 侯 鑫, 孫東方 于文超 何 成 王曉通

(1. 魯東大學 農學院, 山東 煙臺 264025; 2. 山東海洋資源與環境研究院, 山東 煙臺 264006; 3. 魯東大學生命科學學院, 山東 煙臺 264025)

紫貽貝(Mytilus edulis)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、異柱目(Anisomyaria)、貽貝科(Mytilidae)、貽貝屬(Mytilus)。貽貝種類很多, 僅中國沿海就有 30多種, 其中經濟價值較高的有10多種。脈紅螺(Rapana venosa)屬軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、新腹足目(Neogastropoda)、骨螺科(Muricidae)、紅螺屬(Rapana),自然分布于西北太平洋的日本海、渤海、黃海、東海等海域, 是重要的經濟物種。

黑色素(Melanin)主要是由酪氨酸氧化反應, 隨后通過聚合反應, 而產生的一種生物多聚體, 是生物色素中分布范圍最廣的色素之一[1], 一般呈黑色或棕褐色, 廣泛存在于動植物中, 是一種難溶于水、酸及有機溶劑的生物大分子[2]。隨著對天然黑色素的深入研究, 人們發現, 天然的黑色素存在巨大的潛在價值和藥理, 在化妝品和功能性食品等領域有廣泛應用[3]。目前人們對細菌、海綿(Spongiatia)[4]、真菌[5]、鯰魚(Heteropneustes fossilis)[6]、烏雞(Gallus gallus)[7]中的黑色素都有一定程度的研究與開發。本研究團隊曾經發現長牡蠣外套膜、貝殼和閉殼肌痕處均存在黑色素, 但黑色素在貝類的其他器官或者其他貝類中是否存在, 目前尚不明確。

作者發現紫貽貝的貝殼和脈紅螺的厴呈現黑色或黑紅色, 但目前還沒有實驗證明其中的黑色物質是何種成分, 本實驗計劃提取這兩處部位中的黑色物質并進行鑒定, 希望可以確定紫貽貝貝殼和脈紅螺厴中是否含有黑色素。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

本實驗選取山東省煙臺市海濱的紫貽貝與脈紅螺為實驗材料, 購于魯東大學農貿市場。紫貽貝貝殼與脈紅螺厴的示意圖如圖1所示。

1.2 實驗儀器與試劑

TU-1810紫外分光光度計、傅里葉紅外光譜儀、電熱恒溫水浴鍋、電熱套、電子密度天平、冷凝管、燒杯、索氏提取器、抽濾器、研缽、布氏漏斗、玻璃棒等。所用實驗試劑包括鹽酸、氫氧化鈉、溴化鉀、乙醚、蒸餾水等。

圖1 紫貽貝貝殼與脈紅螺厴的示意圖Fig.1 Shells of Mytilus edulis and operculum of Rapana venosa

1.3 兩種實驗樣品中色素的提取

1.3.1 材料處理

分別將紫貽貝貝殼和脈紅螺厴清理干凈。

1.3.2 粉碎

在60 ℃烘箱中烘干一夜, 至完全去除水分, 用研缽將2份樣品分別研磨成精細的粉末。

1.3.3 浸泡水解

1.3.3.1 貽貝貝殼

共稱量貝殼粉末140 g平分兩份各置于1 000 mL的燒杯中, 分別將280 mL的6 mol/L的鹽酸緩慢倒入兩燒瓶中, 邊倒邊用玻璃棒攪拌; 此步驟應格外注意, 倒入鹽酸時要緩緩倒入, 否則會因反應過于劇烈而溢出燒杯; 置12 h以上使其充分反應。

1.3.3.2 脈紅螺厴

共取厴粉末32.5 g置于1 000 mL的燒杯中, 將130 mL的6 mol/L的鹽酸緩慢倒入燒瓶中; 進行此步驟時, 不會像使用鹽酸浸泡貽貝貝殼一樣反應劇烈, 其原因可能是兩樣品中成分有所差異造成的;置12h以上使其充分反應。

1.3.4 沸水浴

1.3.4.1 貽貝貝殼

經 12 h浸泡, 貝殼殼粉能被溶解大部分, 將浸泡過貝殼粉末的鹽酸溶液棄去少許, 留殘渣, 將帶有殘渣的剩余液體倒入1 000 mL 圓底燒瓶中, 再加6 mol/L 鹽酸溶液 420 mL, 安裝上冷凝管裝置置于電熱套上沸水浴加熱1 h; 目的是進一步增加反應完全度, 這一步也可以使殼中可能存在的微量蛋白質徹底變性而沉淀, 以免對實驗結果產生影響。經此步驟, 殘渣基本完全溶解, 只留有微量的固體物質。

1.3.4.2 脈紅螺厴

經 12 h以上的浸泡之后, 仍殘留大量殘渣, 將浸泡過厴粉末的鹽酸溶液棄去上清留殘渣, 將殘渣倒入1 000 mL 圓底燒瓶中再加6 mol/L 鹽酸溶液195 mL, 安裝上冷凝管裝置置于電熱套上沸水浴加熱 1 h, 使其進一步反應充分。在沸水浴結束時, 同貽貝貝殼一樣, 只留有些許固體物質, 其余都已溶解。

1.3.5 抽濾

取下圓底燒瓶, 待冷卻后, 將瓶內的液體用布氏漏斗抽濾, 棄去濾液, 保留濾渣。注意上述步驟中是將貽貝貝殼均分為 2份同時進行的, 所以在此步驟抽濾時也應兩份同時抽濾。

1.3.6 脫脂

將濾渣用濾紙包好, 置于索氏提取器中, 用乙醚在42 ℃左右的水浴中脫脂, 待索氏管中乙醚呈現出澄清狀態, 約為1 h左右, 脫脂結束, 再將濾紙包取出, 在抽濾裝置上用蒸餾水反復洗滌多次。

1.3.7 干燥

最后在 80 ℃恒溫干燥箱中烘干濾紙包, 取下濾紙上的黑色固體物質。

1.4 樣品部位處色素的鑒定

1.4.1 紫外光譜鑒定

將紫貽貝貝殼和脈紅螺厴中提取的黑色固體物質各取微量, 分別溶解在少量的 0.01 mol/L氫氧化鈉水溶液中, 并用同樣的氫氧化鈉水溶液作為空白對照, 在 190～500 nm的范圍內進行紫外光譜掃描,得到的數據使用Origin軟件制作吸收曲線。

1.4.2 紅外光譜鑒定

按照1∶100比例各取微量兩種樣品提取的黑色固體粉末與 KBr干粉混合, 研磨均勻后壓片, 測定500～4 000 cm–1的紅外光譜, 然后進行對比分析。

1.5 色素提取率的計算

色素提取率即提取得到的色素量占樣品總量的百分比, 計算公式為

2 結果與分析

2.1 2份樣品中的色素提取率

2.1.1 紫貽貝貝殼色素提取率

本次實驗取貽貝貝殼共140 g, 經實驗提取, 得到0.092 g的色素樣品, 所以貽貝貝殼的色素提取率為0.066%。

2.1.2 脈紅螺厴色素提取率

本次試驗取脈紅螺厴共 32.5 g , 經實驗提取,得到0.011 g的色素樣品, 所以脈紅螺厴的色素提取率為0.034%。

2.2 紫貽貝貝殼中色素的光譜特征

2.2.1 紫貽貝貝殼中色素的紫外光譜特征

紫貽貝貝殼中色素的紫外光譜掃描結果如圖 2所示。光譜掃描結果表明, 紫貽貝貝殼中的色素在紫外波長下存在明顯吸收特征, 并有最大吸收峰, 其最大值在214 nm處(圖2), 并且隨著波長的增加, 其吸光值也下降, 與Bell[8]報道的黑色素紫外吸收特征一致。

圖2 紫貽貝貝殼中色素的紫外掃描圖譜Fig.2 UV absorption spectra: pigment in the Mytilus edulis shells

2.2.2 紫貽貝貝殼中色素的紅外光譜特征

紫貽貝貝殼中色素的紅外光譜掃描結果如圖 3所示。從圖中可見, 本實驗所提取的紫貽貝貝殼中色素的特征吸收峰主要集中在以下3組峰: 3 500～3 300 cm–1、1 620～1 600 cm–1和 1 150～1 000 cm–1,其中3440 cm–1處強吸收峰是由O—H和吲哚的N—H伸縮振動產生的, 1 630 cm–1附近吸收峰為真黑色素的吲哚環歸屬, 1 095 cm–1處的吸收峰, 部分由烷烴中C—CH3的彎曲和骨架振動吸收參與形成[9-10]。動物源黑色素多屬吲哚型, 根據構成黑色素結構單元骨架是吲哚還是苯丙噻嗪, 又將動物黑色素分為真黑色素和脫黑色素兩大類[11], 而根據圖 3中的吸收峰特征, 可以判斷紫貽貝貝殼中提取的色素為真黑色素。

圖3 紫貽貝貝殼中色素的紅外掃描圖譜Fig.3 IR spectra: Pigment in the Mytilus edulis shells

2.3 脈紅螺厴中色素的光譜特征

2.3.1 脈紅螺厴中色素的紫外光譜特征

脈紅螺厴中色素的紫外光譜掃描結果如圖 4所示。光譜掃描結果表明, 脈紅螺厴中色素在紫外波長下存在明顯吸收特征, 并有最大吸收峰, 其最大值在216 nm處(圖4), 并且隨著波長的增加, 其吸光值也下降, 與紫貽貝貝殼中色素的紫外光譜相似, 也與Bell[8]報道的黑色素紫外吸收特征基本一致。

圖4 脈紅螺厴中色素的紫外掃描圖譜Fig.4 UV absorption spectra: Pigment in the Rapana venosa operculum

2.3.2 脈紅螺厴中色素的紅外光譜特征

脈紅螺厴中色素的紅外光譜掃描結果如圖 5所示。從圖5可見, 本實驗所制備的脈紅螺厴中色素的特征吸收峰也主要集中在以下3組峰: 3 500～3 300 cm–1、1 620～1 600 cm–1和 1 150～1 000 cm–1, 我們知道, 3 440 cm–1處強吸收峰是由O—H和吲哚的N—H伸縮振動產生的, 1 630 cm–1附近吸收峰為真黑色素的吲哚環歸屬, 1 095 cm–1處的吸收峰, 部分由烷烴中 C—CH3的彎曲和骨架振動吸收參與形成[9-11],與紫貽貝貝殼中色素的紅外吸收特征一致, 因此作者判定, 紫貽貝貝殼中的色素與脈紅螺厴中的色素均為真黑色素。

圖5 脈紅螺厴中色素的紅外掃描圖譜Fig.5 IR spectra: Pigment in the Rapana venosa operculum

3 討論與結論

實驗結果表明, 紫貽貝貝殼與脈紅螺厴中均含有黑色素, 說明黑色素在貝類中的具有較廣泛的分布, 除了在長牡蠣外套膜、貝殼和閉殼肌痕處均存在黑色素之外(本課題組未發表的數據), 黑色素在其他貝類或貝類的其他器官中均存在。貝類含有黑色素對于貝類自身有何影響、有何生物學意義, 是一個值得研究的問題。

研究黑色素對于貝類育種也具有重要價值。迄今, 已有對貝類其他色素的提取和利用并取得了一定的研究成果, 如扇貝貝殼和閉殼肌中類胡蘿卜素的提取和鑒定已有報道[12-13], 并育成了顏色明亮、營養價值較高的蝦夷扇貝( Patinopecten yessoensis )和華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis )新品(種)系。黑色素也具有抗氧化、抗衰老的作用[14], 與胡蘿卜素的生理作用相似, 本研究對貽貝貝殼中黑色素成功的進行了提取、鑒定, 證明了紫貽貝貝殼中也存在黑色素,對于紫貽貝的殼色育種具有重要的參考價值。另外,已有研究表明在長牡蠣殼中含有黑色素這一物質,而紫貽貝與牡蠣同為雙殼綱(Bivalvia)貝類, 說明黑色素在雙殼綱貝類中的存在可能是比較廣泛的。

脈紅螺的厴是一種比較特殊的礦化結構, 厴是腹足綱貝類著生于后足上面的板狀結構, 軟體部縮入貝殼內后藉此堵封殼口。本次實驗提取并驗證了厴中的黑色物質也為黑色素, 這是首次對腹足綱動物礦化結構所含色素進行提取和鑒定, 也說明黑色素在雙殼綱和腹足綱貝類都是存在的。另外, 黑色素在頭足綱動物中的存在早已得到確定[15], 結合本次實驗的結果, 可以推測黑色素在軟體動物中是廣泛存在的一種色素。

[1] Kollosa N. New trends in photobiology, phytoprotection by melanins[J]. Phytochem Photobiol, 1991, 9(1):135-160.

[2] Bassam S E, Benhamou N, Carisse O, et al. The role of melan in in the an tagonistic interaction between the apple scab pathogen Venturia inaequalis and Microsphaeropsis ochracea[J]. Canadian Journal of Microbiolog, 2002, 48(4): 349-358.

[3] Zhang M, Xiao G, Thring R W, et al.Production and characterization of melanin by submerged culture of culinary and medicinal fungi Auricularia auricula[J].Appl Biochem Biotechnol, 2015, 176(1): 253-266.

[4] Araujo M, Xavier J R, Nunes C D, et al. Marine sponge melanin: a new source of an old biopolymer[J].Structural Chemistry, 2012, 23(1): 115-122.

[5] Langfelder K, Streibel M, Jahn B, et al.Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi[J]. Fungal Genet Biol, 2003, 38(2):143-158.

[6] Kumar R, Joy K P. Melanins as biomarkers of ovarian follicular atresia in the catfish Heteropneustes fossilis:biochemical and histochemical characterization,seasonal variation and hormone effects[J].Fish Physiol Biochem, 2015, 41(3): 761-772.

[7] Chen S R, Jiang B, Zheng J X , et al. Isolation and characterization of natural melanin derived from silky fowl (Gallus gallus domesticus Brisson)[J]. Food Chemistry, 2008, 111(3): 745-749.

[8] Bell A A, Wheeler M H. Biosynthesis and functions of fungal melanins[J]. Ann Hev Phytopathol, 1986, 24:411-451.

[9] 王巖, 劉學惠, 尹佩玉, 等.幾種天然黑色素分子結構的紅外光譜表征研究[J].分析試驗室, 1996, 15(6):63-65.

[10] 趙肅清, 孫明遠, 蔡燕飛, 等.香蕉皮黑色素的鑒定及其抗氧化作用研究[J].中草藥, 2002, 33(6):496-498.

[11] Nicolaurs R A, Piattellim, F E. The syructure of melanin and melanogenesis-IV: On some natural melanins[J]. Tetrahedron, 20(5): 1163-1172.

[12] Li N, Hu J J, Wang S, et al. Isolation and identification of the main carotenoid pigment from the rare orange muscle of the Yesso scallop[J]. Food Chemistry, 2010,118(3): 616-619.

[13] Zheng H P, Liu H L, Zhang T, et al. Total carotenoid differences in scallop tissues of Chlamys nobilis(Bivalve: Pectinidae) with regard to gender and shell colour[J]. Food Chemistry, 2010, 122(4): 1164-1167.

[14] Lu Y, Ye M, Song S, et al. Isolation, purification, and anti-aging activity of melanin from Lachnum singerianum[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2014, 174(2): 762-771.

[15] Derby C D. Cephalopod ink: production, chemistry,functions and applications[J]. Marine Drugs, 2014,12(5): 2700-2730.