酵母菌發酵人參藥渣產物對腸道黏膜損傷小鼠腸道IgA分泌的影響*

練高登，謝 輝，馮佳婷，肖 丹

(長春工業大學)

0 引言

近代以來，中藥告別了傳統的單一個體應用的時代，開始了中藥制劑、中成藥等企業化、規模化生產，隨之產生的中藥藥渣也以每年數十萬噸遞增、積累．據文獻報道，中藥藥渣中殘留約30%～40%的藥用指標成分外，還大量的粗蛋白、粗脂肪、有機物、微量元素及一些未知的促生長物質．李艷軍等［1］對藿香正氣藥渣中的營養物質含量進行測定，結果表明粗蛋白含量約為13%，粗脂肪約為3%，各種纖維含量約為60%，鈣磷含量約為7%左右．將其按一定比例添加到泌乳母兔的飼料中，對母兔的泌乳及仔兔的生長性能都有提高．由此表明，直接將加工后的中藥藥渣直接添加與飼料中，會影響到飼料的適口性，甚至會產生毒性．借助于微生物的分解作用可以降低藥物的毒副作用，同時可以促進中藥中的一些大分子如纖維素等的生物轉化，提高小分子蛋白和游離氨基酸的含量［2-3］．王兵等［4］利用白腐菌對中藥渣進行固態發酵，其蛋白質量分數高71%，而粗纖維質量分數降低了12%．利用微生物對藥渣進行發酵，提前能把藥渣中營養早分離早分解，提高吸收率，同時發酵藥渣中含有大量的益生菌存在，促進腸道微生態的平衡．因此最終得到的產品具有中草藥和微生物的雙重功效．微生物發酵中藥藥渣在當今動物生產上的應用與開發將成為人們研究的一大熱點［5］．

人參提取工藝多采用醇提法提取含皂苷等活性成分，研究表明用60%乙醇提取人參后的藥渣，含有大量的人參總皂苷及多糖，同時還含有大量的人參木質素及纖維、蛋白質、淀粉．楊東川等［6］研究發現利用枯草桿菌發酵紅參藥渣后對小鼠的繁殖性能具有一定的促進作用．酵母菌是一些單細胞真菌，是人類文明史中被應用得最早的微生物．該菌種因分布廣泛，培養簡單，易于分離，耐熱，抗逆性強等特點而成為微生物發酵研究的熱點［7-8］，同時酵母菌也是腸道微生態的調節劑．腸道微生態一直被認為廣泛地參與了宿主營養吸收，腸道與免疫系統的發育等重要的生理過程，其變化與多種疾病的發生，發展和轉歸密切相關．劉艷艷等研究表明灌胃人參皂苷后小鼠腸道菌群結構發生改變，熒光假單胞菌和丁酸梭菌數量明顯增加［9］．但有關于人參藥渣對腸道黏膜保護作用的研究的尚未有報道．

該研究采用環磷酰胺腹腔注射小鼠，構建腸道黏膜損傷的動物模型，研究酵母菌發酵人參藥渣后的產物對腸道黏膜免疫保護作用．以期為開發動物腸道黏膜損傷性疾病的功能性飼料及中藥渣發酵產物的再利用提供依據．

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物

BALB/c小鼠(健康，體重18～22 g，6～8周齡)，購自吉林大學實驗動物中心．

1．1．2 實驗藥品

酵母菌(Bacillussubtilis，由長春工業大學制藥教研室提供);人參中藥渣(由吉林省人參科學院提供);環磷酰胺購自吉林省藥品監督所;，Mouse SIgA ELISA Kit，小鼠單克隆β-actin-HRP，羊抗鼠IgA-HRP等購自北京寶泰克公司．

牛肉浸膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉SDS、甘氨酸、過硫酸銨(APS)等購自上海浩然生物制品有限公司．

1．1．3 主要儀器

電子天平(上海卓精電子科技有限公司);高壓滅菌鍋(德國IRM公司);電熱鼓風干燥箱(上海典晟試驗實驗儀器廠);粉碎機(濰坊設備廠);XSP-35TV光學顯微鏡(深圳博士達光學儀器有限公司);ELx808酶標儀(美國伯騰公司;Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(美國伯樂);臥式恒溫搖床(上海典晟試驗實驗儀器廠)．

1．2 方法

1．2．1 液體培養基制備

分別稱取牛肉浸膏 5．0 g、蛋白胨 10．0 g、氯化鈉5．0 g置于 1000 mL燒杯，加入蒸餾水800 mL，加熱攪拌至混勻．靜置冷卻至室溫，加入氫氧化鈉溶液調 pH=7．2～7．4后加水至1000 mL．將制備好的液體培養基平均分裝于3個錐形瓶，于121℃、0．1MP條件下滅菌30 min．

1．2．2 種子液制備

取適量酵母菌接種于上述培養基中，置于搖床中震蕩培養過夜(37℃﹑160 r/min)．采用麥氏比濁法測定菌液濃度，菌液濃度達1×109cfu/mL可用于發酵試驗．

1．2．3 人參藥渣的發酵

將醇提過的人參藥渣烘干后粉碎過篩，取20 g藥渣于100 mL錐形瓶，加入12 mL的蒸餾水(W/V=0．6放于高壓滅菌鍋內121℃滅菌30 min．冷卻至37℃后，接種培養好的酵母菌菌液(接種量約為5%)．將接種后的錐形瓶中液體混勻置于37℃下發酵培養5～7d后烘干(25～30℃)．

1．2．4 陽性對照藥品用量確定

人參皂苷Rg3具有提高人體免疫力的功能，臨床上常用來輔助治療腫瘤．根據關于人參皂苷Rg3提高免疫力的相關報道［10-12］，經實驗表明選取Rg3的劑量為15 mg/kg(與體重比)為陽性對照藥的用藥劑量．

1．2．5 人參藥渣發酵產物最佳添加比例的確定

選取24只BALB/c小鼠飼養一周后，隨機分成4組，每組6只．依次按1%﹑3%﹑5%的比例在飼料中添加發酵后的人參藥渣，并設置空白對照組．在保證次日投料有剩余的前提下，相同飼喂量飼喂一周．觀察各組采食，飲水，排便及體重變化，比較料重比及日增重得出藥渣最佳添加比例．

1．2．6 動物模型的建立及飼喂試驗

選取32只BALB/c小鼠，適應性應性飼喂一周后，隨機分為4組，每組8只．分別按照表1進行小鼠的飼喂試驗．發酵人參藥渣按試驗1．2．5得出的最佳添加的比例與飼料混合．在相同的條件下飼喂各組小鼠，每天定時記錄各組小鼠的飼料消耗，計算平均日采食量．飼喂一周后對各組小鼠進行體重測定，計算各組小鼠平均的日增重及料重比．分別將模型組，陽性對照組及人參藥渣組的小鼠腹腔注射環磷酰胺(5 mg/g)，正常組注射等體積的滅菌生理鹽水．相同條件下連續飼養三周后，將小鼠禁食不禁水24 h，進行各項指標檢測．

表1 小鼠分組飼喂情況

1．2．7 小腸黏膜SIgA含量測定

參照文獻［13］申金雁等方法剪取空腸段約5 cm，輕輕去除內容物后，用滅菌的生理鹽水沖洗．縱向剪開腸壁，用載玻片刮取腸黏膜．準確稱取1g的黏膜液，加入18 mL PBS(pH=7．4)漂洗冰浴勻漿，5000 r/min離心10 min．收集上清液即為10%的黏膜液，按鼠SIgA-ELISA試劑盒說明書，測定單位質量小腸SIgA的含量．

1．2．8 Western-blotting檢測小腸 IgA 的表達量

在腸道分泌物中存在大量的分泌型的IgA(SIgA)，約占IgA總量的60%以上，在粘膜免疫中發揮重要作用．為進一步研究發酵人參藥渣對小腸黏膜IgA抗體表的影響及與小腸SIgA的相關性，對各組小鼠中IgA抗體含量進行檢測．按1．2．7方法取出約0．2g小腸，用生理鹽水反復沖洗腸腔至無血跡，用組織剪剪碎．按每100mg組織加入1 mL的含0．01 mmol/L PMSF的RIPA組織裂解液．用組織勻漿機混勻，置于冰浴中裂解20 min后，12000 r/min離心取上清(10min)．BCA法測定蛋白樣品濃度并將蛋白濃度調節至10 mg/mL．將按文獻方法［14］進行的蛋白質 SDS-PAGE電泳及 Western-blotting檢測．選用5%的脫脂奶粉為封閉2液，抗稀釋比分別IgA為1∶3000;β -actin 為 1∶2000．ECL 顯色，暗室中壓片曝光．將膠片掃描拍照后，利用灰度掃描比對軟件進行比對．記錄各試驗組的IgA條帶與β-actin條帶的積分光密度值，每個蛋白重復3次．用兩者平均值的比值表示該樣本IgA的相對表達量．

1．2．9 數據統計學分析

試驗數據采用 SPSS 20．0統計軟件分析進行單因素方差分析，F檢驗比較組間差異．(P＜0．05為差異顯著，P ＜0．01為差異極顯著)．

2 結果與分析

2．1 小鼠體質量變化

由圖1可知，未注射環磷酰前，各組小鼠體質量(相對體重的百分比)變化不大，增加緩慢．一周后進行腹腔注射環磷酰胺造模藥物后，模型組、陽性對照組及藥渣組小鼠于三周后(第26天)體質量均出現顯著下降．提示酰胺對正常小鼠腸道黏膜造成損傷，影響了腸道正?；展δ埽瑥亩鴮е滦∈篌w質量下降．由圖2可知造模前后各組小鼠體質量的相對變化率，結果表明與模型組相比，陽性對照組及藥渣組體質量降低率低，但未呈現顯著性差異．

圖1 小鼠體質量的變化情況(±S，n=8)

圖2 造模后小鼠體質量的變化±s，n=8)

2．2 腸黏膜SIgA含量

腸道黏膜免疫系統損傷時一些密切相關的免疫因子如SIgA也會有所變化．由圖3數據可知，模型組與正常組小鼠腸道SIgA的含量相比差異極顯著(P＜0．01)且降低了32．81%，表明成功構建了腸黏膜免疫屏障損傷的小鼠模型．發酵人參藥渣組SIgA含量相比模型組差異極顯著(P＜0．01)且提高了43．43%，與陽性對照組和正常組相比差異不顯著．陽性對照組與模型組相比，其SIgA含量含量提高了47．57%．投喂發酵人參藥渣后小鼠黏膜SIgA的相對含量顯著升高，表明發酵的人參藥渣對腸黏膜損傷小鼠具有促進SIgA分泌的作用，SIgA分泌量的變化揭示了腸道免疫屏的改變．因此，該試驗結果表明發酵人參藥渣對腸道免疫屏障起到一定保護作用．

圖3 腸黏膜SIgA含量±s，n=8)

2．3 小腸IgA蛋白表達量

小腸IgA蛋白表達水平揭示了腸道免疫水平．由圖4可知，在造模后模型組腸道內IgA蛋白表達量與正常組相比顯著降低，差異極顯著(P＜0．01)．在進行飼喂試驗后，投喂人參藥渣組與模型組相比表達量顯著提高，兩組間差異顯著(P＜0．05)，而與陽性對照組相比差異不顯著．表明發酵人參藥渣組可提高IgA蛋白表達量，從而提高腸道粘膜免疫的水平．不同試驗組中IgA蛋白表達量的變化與小鼠腸道黏膜SIgA抗體變化一致，表明兩者之間正相關．該試驗結果表明，投喂人參藥渣可以促進小鼠腸道黏膜SIgA分泌，這可能與小腸IgA的表達量上升相關．

圖4 小腸IgA蛋白相對表達量±s，n=3)

3 討論

腸黏膜免疫屏障是機體抵制外來病原微生物侵擾的重要防線，當其損傷等應激情況下，腸黏膜結構及免疫功能會受到損傷，如SIgA含量減少等［15］．環磷酰胺(cyclophosvnamide，CTX)是一種化療藥物，在殺傷癌癥細胞的同時，可對腸粘膜屏障造成損傷，并損傷免疫功能．周華等詳細闡明了環磷酸酰胺對小鼠腸黏膜免疫功能的影響［16］．目前利用該藥物已成為首選的藥物被應用于構建小鼠腸黏膜損傷的模型．該研究采用常規方法，腹腔注射環磷酰胺構建小鼠腸道粘膜損傷模型．通過檢測不同試驗組中SIgA含量及IgA蛋白的表達量，比較分析發酵人參藥渣對小鼠腸道粘膜免疫的作用．該研究結果表明，投喂發酵人參藥渣組小鼠腸道SIgA含量與模型組相比顯著升高(p＜0．01)，與陽性對照組相比差異不顯著．SIgA是腸黏膜免疫屏障的主要效應因子，不但有防御和清除病原體和毒素的作用，還能減弱免疫耐受的形成［17-18］．腸道內SIgA主要由腸黏膜中的成熟漿細胞分泌，筆者認為發酵人參藥渣可同通過非特異性的免疫刺激，刺激了漿細胞分泌SIgA，使腸道SlgA維持在一個較高的水平，改善腸道局部免疫功能．

研究表明，sIgA介導的腸黏膜免疫應答在很大程度上依賴于細胞因子的參與如GALT的T細胞和白細胞介素、轉化生長因子等［19］．但關于SIgA與IgA含量在相同環境中的變化及相關性的報道很少，該研究進一步表明發酵人參藥渣不但促進SIgA分泌量，還可以顯著提高小腸組織的IgA蛋白表達量．提示發酵藥渣可能通過促進腸道漿細胞分泌IgA蛋白的同時促進sIgA的分泌，但是IgA的含量變化與SIgA的增加量并未呈現線性關系，推測SIgA的分泌可能受多方面因素的影響，除了受IgA含量的影響外，還可能與其它蛋白(pIgR)及細胞轉運功能有關．

該研究結果表明發酵人參藥渣可增強腸道免疫機能，提高腸道粘膜免疫能力，進而可改善環磷酰胺誘導的小鼠腸黏膜損傷．其作用機理是促進了腸道分泌IgA和SIgA蛋白．該研究為人參藥渣的綜合利用提供了技術支撐和理論依據，同時為腸道分泌IgA和SIgA蛋白的機制研究奠定基礎．

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