3xTg-擬AD小鼠腦內七種時鐘基因啟動子區甲基化分析

包訓杰 蔡彥寧 祝艷秋 楊翠翠 李 林 張 蘭*

(1.首都醫科大學宣武醫院藥物研究室，北京100053;2.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室，北京100053;3.神經變性病教育部重點實驗室，北京100053)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種最常見的癡呆類型和精神障礙。據估計我國有600～700萬阿爾茨海默癥患者，60歲及以上人口的癡呆患病率平均為3.5%。全球大約有4 000萬人患有該病，并且患病人數在未來十年里將呈爆炸式增長［1-2］。AD患者中常出現生理節律紊亂，據研究［3-4］報道，在65歲以上的AD患者中超過80%出現過睡眠障礙、體溫波動、激素分泌異常以及糖代謝的異常。這些異常，常常出現在疾病的早期，甚至可以成為AD疾病的預測工具或者是AD病理進展的診斷靶標。因此，研究這種生理紊亂意義重大。

哺乳動物的生理節律中樞位于下丘腦視上交叉核，擁有10 000～15 000個神經元［5-6］，而在一些外周器官，如肝臟、腎臟和心臟等也存在時鐘節律調控點，他們共同控制機體的節律表現［7-8］。其除受一些外界影響如光照外，在分子水平主要由一些時鐘基因調控，例如 per1、per2、cry1、cry2、bmal1、bmal2、clock 和 npas2等［9］。這些基因在轉錄、翻譯以及翻譯后修飾水平相互作用形成了一個反饋回路，共同影響機體的整體晝夜節律［10］。由于基因轉錄和蛋白轉運入核需要一定時間，生物分子震蕩周期正好維持24 h左右。因此，整個生理節律過程可在不同水平、不同時間點受到影響，而一旦某個點發生改變，可能會引起整個網絡的改變，最終使患者發生各種各樣的生理紊亂現象。

DNA啟動子區甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾手段［11］，其可影響基因的表達水平，通常在多種癌癥的發病機制中扮演重要角色［12］。有研究［13］表明CpG島的高度甲基化可影響時鐘基因的轉錄。那么，AD疾病所引起的生理紊亂就有可能是DNA啟動子甲基化所引起的。

在本實驗中，筆者采用了3xTg小鼠，通過將APPSwe和tauP301L同時顯微注射進PS1M146V基因敲入小鼠的單細胞胚胎中，得到的攜帶APPSwe、tauP301L、PS1M146V基因的三重轉基因小鼠［14］。3xTg-AD小鼠的神經病理學發生的區域-時程模式十分近似地模擬了AD，而且出現AD的主要病理學變化——Aβ沉積和神經纖維纏結，同時伴隨突觸丟失、神經元死亡等，并且出現晝夜體溫變化和活動規律異常。

1 材料和方法

1.1 材料

TIANamp Genomic DNA Kit，50 bp DNA Maker(天根生化科技有限公司);Wizard DNA purification resin(Promega，Madison，WI公司，美國);HS Taq 酶(Takara公司，日本);GelGreen(Biotium，CA公司，美國);SssI CpG甲基轉移酶(New England Biolab公司，美國)。

1.2 動物

3xTg小鼠從美國Jackson實驗室引進，并自行進行繁育，每只小鼠均經過基因型鑒定，飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所SPF級環境。動物依據體質量進行完全隨機分組。分組方法為:用Excel軟件給每只小鼠隨機編號，編號與每只動物體質量相對應。對編號為1的小鼠產生隨機號，并用填充柄拖曳，使所有動物均編上不同的隨機號，通過復制和選擇性粘貼對數值加以固定。對產生的隨機號進行遞增排序，按照隨機號從小到大的順序，把動物分成實驗所需的組數。實驗動物分為2組，模型組采用3xTg小鼠15只(雄性8只，雌性7只)，14月齡，體質量30～40 g。對照組采用3xTg轉基因陰性背景小鼠15只(雄性8只，雌性7只)，14月齡，體質量30～40 g。飼養條件:每日光照12 h，黑暗12 h，室溫23℃，任意攝取水食。相同時間全部處死后，取小鼠新鮮腦組織-80℃凍存待用。實驗全過程對動物的飼養與取材均遵守實驗動物管理與保護的相關政策和規定。

1.3 基因組DNA提取與亞硫酸氫鹽處理

基因組DNA的提取按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書進行。取小鼠下丘腦組織，加入600 μL裂解液勻漿10 000 r/min離心1 min。本實驗洗脫液TE的量為50 μL，-80℃保存。使用偏重亞硫酸氫鈉和對苯二酚對基因組DNA進行處理。通過該處理，未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。之后用設計好的兩對引物分別擴增甲基化與非甲基化的片段。處理過程如下，1 μg基因組DNA使用0.3 mol/L的NaOH進行變性。而后使用新鮮配置的偏重亞硫酸氫鈉(終濃度3.0 mmol/L，pH 5.0)與對苯二酚的混合溶液(終濃度0.5 mmol/L，pH 5.0)與基因組DNA混合，石蠟油覆蓋，避光50℃孵育16 h。之后使用Wizard DNA purification resin純化回收鹽處理過的DNA。

1.4 啟動子分析及引物設計

時鐘基因啟動子分析應用在線軟件(http:∥www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)。分析per1、per2、cry2、clock、npas2、bmal1、bmal2 共 7 個時鐘基因啟動子區轉錄起始位點上下游各600 bp長度序列。并用該軟件設計時鐘基因啟動子區MSP引物。由于MSP只能檢測引物3區大約3～4個CpG位點，位于引物以外和引物之間的序列不能檢測到，因此可能出現假陰性結果。為避免此問題，每個基因設計了2對引物，用于擴增同一啟動子區不同的位點。MSP引物見表 1，2。

表1 時鐘基因啟動子甲基化分析第一套引物Tab.1 The first set of primers used for methylation analysis in the promoter of seven clock genes

Mr CGCGAAAAAATAATACTTAACCGCTACG Uf TTGGTTTTTTGGATTATTGAGGTTGGTTATGTTG 115 Ur CTACAACACAAAAAAATAATACTTAACCACTACA Cry2 Mf TTTTCGGTGTATTGGTTTCGTAAAGGATTAC 113 Mr AACCACGAATCGAAAATATAAACGCAACG Uf TGTTTTTGGTGTATTGGTTTTGTAAAGGATTATG 120 Ur CCACAAACCACAAATCAAAAATATAAACACAACA Clock Mf CGTCGGGAGGTAGCGTAATTAC 121 Mr GCACTCACCGAAAACGCG Uf TATGATGTATGTGTTGGGAGGTAGTGTAATTATG 143 Ur CCCAATAAAACACACTCACCAAAAACACA Npas2 Mf CGGAGTTTCGAGATTTCGGC 90 Mr ACCGAAACGACAAACGAACTCG Uf GGTTGTGGAGTTTTGAGATTTTGGTG 105 Ur ACCACAAAAAACCAAAACAACAAACAAACTCA Bmal1 Mf TTTTCGGGCGGGCGTATC 86 Mr CCTTTAAAACCGACAACGAACACG Uf GTGAGTTTTTGGGTGGGTGTATTG 98 Ur CACAAACCCTTTAAAACCAACAACAAACACA Bmal2 Mf TTTTGTTGAGGTTTCGTTCGTGC 163 Mr CCCGACACAATTTCGAAATCTCG Uf GGTTTTGTTGAGGTTTTGTTTGTGTG 176 Ur TATTAAAAACACCCAACACAATTTCAAAATCTCA

表2 時鐘基因啟動子甲基化分析第二套引物Tab.2 The second set of primers used for methylation analysis in the promoter of seven clock genes

1.5 甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)

偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA用HS Taq進行擴增。M引物的擴增子是發生甲基化改變的序列，U引物的擴增子是未發生甲基化改變的序列。PCR(polymerase chain reaction)產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料使用GelGreen。為了確定MSP處理的特異性，SssI甲基轉移酶處理的基因組DNA作為陽性對照，未經偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為陰性對照。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0進行數據分析。計數資料采用頻數和百分數表示，組間比較采用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3xTg-擬AD小鼠腦內時鐘基因啟動子區甲基化特異條帶的擴增

為提高實驗的靈敏度和可靠性，筆者應用兩套引物分別檢測7個主要時鐘基因(per1、per2、cry2、clock、npas2、bmal1和bmal2)啟動子區甲基化。正常小鼠腦內，7個主要時鐘基因啟動子區呈非甲基化狀態，3xTg擬AD小鼠腦內時鐘基因啟動子區出現部分甲基化改變。

以clock基因PCR產物電泳結果為例進行說明。如圖1所示:M代表甲基化引物擴增子，即clock基因CpG島發生甲基化的片段;U代表非甲基化引物擴增子，即clock基因CpG島未發生甲基化的片段。甲基轉移酶(SssI)處理的基因組DNA作為陽性對照，其甲基化擴增產物(M)出現在121bp位置，非甲基化擴增產物出現在143bp位置，符合預期。未經鹽處理的基因組DNA作為陰性對照，兩對引物均未擴增出目的條帶。小鼠腦樣本若出現和甲基化擴增產物一致的條帶，則說明存在甲基化改變;若未出現M擴增產物僅擴增出U條帶，說明未發生甲基化改變(圖1)。

2.2 3xTg-擬AD小鼠腦內時鐘基因啟動子區甲基化的改變

檢測7個時鐘基因啟動子區甲基化發現:cry2基因啟動子區在轉基因陰性小鼠腦內未出現甲基化，而在3xTg-擬AD小鼠腦內甲基化發生率增高至20%(圖2，表3)。

圖1 Clock基因PCR產物電泳圖Fig.1 Methylation analysis of clock promoters

Clock和bmal2基因啟動子區甲基化在模型小鼠腦內發生率為6.67%，轉基因陰性組未出現甲基化(圖2，表 3)。

Per1、per2、npas2和bmal1基因啟動子區在3xTg-擬AD小鼠和轉基因陰性小鼠腦內均未出現甲基化改變(表3)。

3 討論

甲基化特異性PCR(MSP)是一種簡單快速和經濟的檢查CpG島甲基化狀態的方法。由于每對引物只能檢測3～4個甲基化位點，因此容易出現假陰性結果。為此，除了per1之外，筆者為每個基因設計了2對引物，其中一對針對甲基化的DNA(M)另一對針對非甲基化的DNA(U)，用于擴增同一啟動子區不同的位點。實驗關鍵步驟——鹽處理過程會使DNA降解達90%以上，故初始DNA處理量在1 μg為宜，而小鼠腦組織DNA豐度較低，為實驗帶來一定困難。

現今，AD治療手段匱乏，所有針對AD的藥物臨床實驗都以失敗告終，而生理節律的異常不僅可以為AD早期診斷提供線索，而且已有研究［15-17］表明，AD引起的生理節律紊亂可反過來加重AD的病情，而重置生理時鐘可以改善患者心理及代謝情況，延長患者生命，這成為治療AD的一個新的靶點［18］。因此，研究時鐘網絡異常的分子機制就顯得十分重要。Cedernaes等［19］研究發現正是bmal1、cry1、per1基因啟動子區甲基化修飾引起轉錄改變是導致患者急性睡眠障礙的原因。Song等［20］報道了時鐘基因翻譯后水平的調控，他們發現AD的重要病理Aβ沉積可導致時鐘網絡核心蛋白bmal1和cbp的降解。還有一些大樣本量研究［21］中也證實，同樣存在生理節律紊亂的帕金森病患者當中，npas2基因的甲基化水平明顯低于正常人。

圖2 時鐘基因PCR產物電泳圖Fig.2 Methylation analysis of clock genes using set I primers

在整個時鐘基因網絡中，clock和bmal1(在有的組織是bmal2)起到核心作用，其轉錄蛋白clock和baml1可以通過PAS結構域形成異二聚體，結合到per和cry基因啟動子E-boxes［CACGTG］上從而調節基因表達。而當per和cry蛋白產生過多又會進入細胞核形成聚集體抑制clock-bmal1調節轉錄因子形成負反饋環路［22］。同時clock-bmal1異二聚體也激活孤兒受體rev-erbα基因轉錄，其表達蛋白 rev-erbα可與bmal1啟動子結合，阻抑bmal1的轉錄，如圖3。clockbmal1異二聚體還可調控下游的鐘控基因［23-24］如 nampt、alas1等。正因為clock與bmal基因的重要性，其表達異常甚至能導致時鐘節律地缺失［25］。近年來的研究［26］還顯示，cryptochrome(包括 cry1和cry2)的異常或缺失，還可能在機體的學習認知障礙產生中起到作用。

表3 模型小鼠和正常對照小鼠時鐘基因啟動子區甲基化數量和頻率Tab.3 Amount and frequency of methylation in the promoters of clock genes in model group and control group

圖3 時鐘基因網絡示意圖Fig.3 The network structure of clock genes

本實驗結果顯示，在15例AD模型小鼠中發現3例cry2基因，1例clock基因和1例bmal2基因啟動子CpG區發生甲基化，而在15例對照小鼠中未發現1例甲基化樣本。雖然模型組與對照組并未顯示出差異有統計學意義，但模型組甲基化頻率高于對照組，且對照組甲基化頻率為0。這啟示我們，時鐘基因啟動子區甲基化引起時鐘蛋白在轉錄水平發生變化，進而導致時鐘網絡異常可能是AD疾病伴隨的生理節律紊亂的潛在機制，但需要更大樣本量研究證實，這為以后的同類研究提供了一些思路。

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