糖氨基酸化合物的合成研究

曾 莉 張建偉

(首都醫科大學化學生物學與藥學院化學生物學系，北京100069)

已有研究［1-5］顯示，Arg-Gly-Asp(RGD)序列肽可用于心血管疾病、骨質疏松和炎性反應等疾病的治療，還可以預防和治療由細胞黏附異常而導致的腫瘤，尤其是發展性腫瘤的轉移;另一方面，RGD序列肽又可作為興奮劑，促進損傷的器官與組織的再生、傷口的愈合等，具有廣泛的生物學功能。

大多數內源性線性肽在循環過程中半衰期較短，其治療效果和生物活性有所減弱。為了獲得可以接受的抗腫瘤轉移效果，往往需要高劑量的含RGD序列的線性肽，這無疑增加了治療費用并有可能導致多余的不良反應。因此，增加肽類化合物穩定性、提高肽的生物活性，是許多藥物化學家們對含RGD肽進行改造的目標。

在自然界，糖基化天然產物的存在是十分普遍的［6-7］。這些天然分子的糖基部分可以通過增加溶解性、調節血漿半衰期、提高結合的特異性而改變母體藥物的藥理活性［8-9］。

作者對含RGD序列肽糖基化化學合成方法進行了研究。利用了葡萄糖醛酸上的羧基與氨基酸上的氨基連接成酰胺鍵，成為一類新型的糖肽，期望糖基化后對RGDV的活性能夠有所改善［9-14］。如能成功，可以在此基礎上進行結構改造為藥物設計提供候選化合物。通過葡萄糖醛酸的糖基化為含RGD肽的結構改造提供一個實用的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器

熔點用SM/XMT型北京科儀電光儀器廠毛細管熔點儀測定(溫度計未校正)，1HNMR和13CNMR由BrukerAM-500磁共振儀測定，CDCl3為溶劑，TMS為內標，ESI-MS用Waters Micromass 2695-2487-ZQ2000-Masslynx 4.0 LC/MS質譜儀測定。HRMS MS用Quattro Micro ZQ2000(Waters公司，美國)質譜儀測定。

1.2 方法

1)3，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-羧酸〔圖 1(2)〕的制備:35℃油浴下，在50 mL茄瓶中加入4.5 mL醋酐和0.2 mL高氯酸，再加入0.458 g葡萄糖醛酸，反應數小時后加入40 mL水，用乙酸乙酯萃取等處理，最后用乙醇-石油醚重結晶得圖1(2)白色固體。

2)3，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-酰基-R(NO2)-G-D(OCH3)-V-OBzl圖2(4)的制備:稱取3，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-羧酸(2)285 mg于100 mL茄瓶中，用5 mL THF溶解，冰浴攪拌下加入128 mg HOBt和195 mg DCC得A溶液。稱取632 mg H-R(NO2)-G-D(OCH3)-V-OBzl于25 mL茄瓶中，加5 mL THF溶解，用NMM調pH至7得B溶液。將B溶液加入A溶液中，調pH值至9。24 h后，過濾，濾液旋干后用200 mL乙酸乙酯溶解，依次用飽和NaHCO3溶液、飽和NaCl溶液、5%KHSO4溶液、飽和NaCl溶液、飽和NaHCO3溶液、飽和NaCl溶液各30 mL洗3次，無水硫酸鈉干燥。過濾旋干，柱層析分離，得圖2(4)白色固體。

2 結果

筆者對葡萄糖醛酸乙酰化反應進行了研究。以葡萄糖醛酸和乙酸酐為原料，通過一步反應，制備得到3，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-羧酸〔圖 1(2)〕0.530 mg。產率:62%。圖 1(2)化合物:1HNMR:(500 MHz，CDCl3):6.43(d，1H，J=3.5 Hz)，5.55(t，1H，J=9.8 Hz)，5.30(t，1H，J=9.8 Hz)，5.15(dd，1H，J1=3.5 Hz，J2=10.2 Hz)，4.48(d，J=10.2 Hz);13CNMR:(75 MHz，CDCl3)170.1，170.0，169.8，169.6，168.6，88.7，69.9，69.1，68.9，68.8，20.8，20.6，20.5，20.4;ESIMS m/z 361(M-1)。HRMS 理論值:(C14H18O11-1)，m/z(361.0771);實測值:(361.0712)。

圖 1 3，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-羧酸的制備Fig.1 Preparation of 3，4，5，6-tetraacetoxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid

筆者將得到的圖1(2)與圖2(3)反應制備得到3，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-酰基-R(NO2)-G-D(OCH3)-V-OBzl〔圖 2(4)〕140 mg，產率 19%。圖 2(4)化 合 物:［α］25D=-21.3(C=0.001，CH3OH);1HNMR:(500 MHz，CDCl3):7.72(s，1H)，7.53(s，1H)，7.49(s，1H)，7.47(s，1H)，7.39(s，1H)，7.36(m，5H)，6.38(d，1H，J=3.6 Hz)，5.54(t，1H，J=10.3 Hz)，5.25(t，1H，J=9.8 Hz)，5.16(dd，2H，J1=12.2 Hz，J2=41.2 Hz)，5.15(dd，1H，J1=11.5 Hz，J2=3.6 Hz)，4.95(dd，1H，J1=6.8 Hz，J2=13.0 Hz)，4.62(m，1H)，4.46(dd，1H，J1=5.2 Hz，J2=8.4 Hz)，4.35(d，1H，J=10.2 Hz)，4.10(dd，1H，J1=5.7 Hz，J2=16.7 Hz)，3.90(dd，1H，J1=5.7 Hz，J2=16.7 Hz)，3.68(s，3H)，2.91(dd，1H，J1=5.6 Hz，J2=17.0 Hz)，2.77(dd，1H，J1=5.6 Hz，J2=17.0 Hz)，2.20(m，1H)，2.19(s，3H)，2.07(s，3H)，2.05(s，3H)，2.04(s，3H)，1.91(m，2H)，1.77(m，2H)，1.67(s，2H)，0.92(d，3H，J=6.8 Hz)，0.89(d，3H，J=6.9 Hz);13CNMR(125 MHz，CDCl3)172.2，171.8，171.4，170.6，170.2，169.8，169.7，169.1，168.8，167.2，159.5，135.3，128.6，128.5，128.3，88.6，70.8，69.5，69.0，67.1，57.9，52.2，52.0，49.4，43.1，40.6，36.1，29.5，20.8，20.7，20.6，20.4，19.0，17.7;ESIMS m/z 940(M)。HRMS 理論值:(C39H54N8O19-1)，m/z(939.3572);實測值:(939.3661)。

3 討論

圖 23，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-酰基-R(NO2)-G-D(OCH3)-V-OBzlFig.2 Preparation of 3，4，5，6-tetraacetoxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxyl-R(NO2)-G-D(OCH3)-V-OBzl

對于長肽的合成來說一般有逐步增長和片段縮合兩種伸長肽鏈的方式，在具體合成某一多肽時，根據不同情況可選擇逐個增長肽鏈法或片斷縮合法。由于葡萄糖醛酸原料價格較高因而筆者選用3，4，5，6-四-乙酰基-四氫吡喃-2-羧酸直接與H-R(NO2)-G-D(OCH3)-V-OBzl四肽經DCC/HOBt作用下一步縮合。由于反應是放熱反應，反應開始時要在冰浴下進行，以便降低副反應。加入HOBt作催化劑，使羧基組分(R-COOH)與 HOBt通過 DCC發生縮和，生成活化酯，可防止副反應的發生。反應產物在水中有一定的溶解度，經反復的酸溶液、堿溶液及氯化鈉飽和溶液清洗，部分產品在水中溶解。同時TLC監測反應進程時葡萄糖醛酸不易顯色，通過比較寡肽原料點的顏色減弱變化程度來確定反應的終點。這樣反應可能沒有完全發生，因而產率較低。該反應雖然產率不高，但在探索糖基肽的合成上作了有益的嘗試，也為藥物的開發和應用提供了新的思維方法。這樣必將會開發出新一代的糖肽類藥物，對新藥的發展產生一定的影響。

［1］ Yu X，Xia W，Li S A，et al.Antitumor effect and underlying mechanism of RGD-modified adenovirus mediated IL-24 expression on myeloid leukemia cells［J］.Int Immunopharmacol，2015，28(1):560-570.

［2］ Zhu J，Fu F，Xiong Z，et al.Dendrimer-entrapped gold nanoparticles modified with RGD peptide and alpha-tocopheryl succinate enable targeted theranostics of cancer cells［J］.Colloids and Surf B Biointerfaces，2015，133(1):36-42.

［3］ Chang M L，Lu S S，Zhang F，et al.RGD-modified pH-sensitive liposomes for docetaxel tumor targeting［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2015，129:175-182.

［4］ Oliveira E A，Faintuch B L.Radiolabeling and biological evaluation of the GX1 and RGD-GX1 peptide sequence for angiogenesis targeting［J］.Nucl Med Biol，2015，42(2):123-130.

［5］ Guo Z，He B，Jin H，et al.Targeting efficiency of RGD-modified nanocarriers with different ligand intervals in response tointegrin αvβ3 clustering［J］.Biomaterials，2014，35(23):6106-6117.

［6］ Zhang J，Zhao M，Peng S.Synthesis of mimetic peptides containing glucosamine［J］.Carbohydr Res，2011，346(13):1977-2003.

［7］ 任麗.糖肽的化學合成研究進展［J］.中國藥物化學雜志，2012，22(2):142-154.

［8］ Corcilius L，Santhakumar G，Stone R S，et al.Synthesis of peptides and glycopeptides with polyproline II helical topology as potential antifreeze molecules［J］.Bioorg Med Chem，2013，21(12):3569-3581.

［9］ Kishore G，Gautam V，Chandrasekaran S.Novel synthesis of carbohydrate fused α-amino γ-lactams and glycopeptides by NIS mediated ring opening of donor-acceptor substituted cyclopropanes［J］.Carbohydr Res，2011，390:1-8.

［10］UI-Islam M，Ha J H，Khan T，et al.Effects of glucuronic acid oligomers on the production，structure and properties of bacterial cellulose［J］.Carbohydr Polym，2013，92(1):360-366.

［11］ Higashi K，Okamoto Y，Mukuno A，et al.Functional chondroitin sulfate from Enteroctopus dofleini containing a 3-O-sulfo glucuronic acid residue［J］.Carbohydr Polym，2015，134(10):557-565.

［12］ Katzenellenbogen E，Kocharova N A，Shashkov A S，et al.Structure of the O-polysaccharide of Edwardsiella tarda PCM 1150 containing an amide of D-glucuronic acid with L-alanine［J］.Carbohydr Res，2013，368(7):84-88.

［13］ Sánchez Lafarga A K，Pacheco Moisés F P，Gurinov A，et al.Dual responsive dysprosium-doped hydroxyapatite particles and toxicity reduction afterfunctionalization with folic and glucuronic acids［J］.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2015，48(1):541-547.

［14］Tavano L，Aiello R，Ioele G，et al.Niosomes from glucuronic acid-based surfactant as new carriers for cancer therapy:Preparation，characterization and biological properties［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2014，118(138):7-13.