小劑量DMBA對大鼠胰腺的致瘤作用

任 宇 侯曉樸 李 丹 李 穎 朱 斌*

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院普通外科，北京大學第九臨床醫學院，北京100038;2.首都醫科大學附屬北京婦產醫院乳腺外科，北京100006;3.首都醫科大學附屬北京地壇醫院介入科，北京100015)

7，12-二甲基苯并蒽(7，12-dimethylbenzanthracene，DMBA)等致癌物質作用于實驗動物可引起腫瘤的發生。文獻［1-3］報道DMBA誘導大鼠產生胰腺癌所用的劑量與時間各不相同，一般說來劑量大，成模時間短，動物病死率高;劑量小則成模時間長，但動物病死率低。該模型的不足之處是采用手術方法進行造模，對操作者技能要求較高，成瘤率不夠穩定。本實驗擬將小劑量DMBA(2 mg/100 g)置入SD(Sprague-Dawley)大鼠胰腺，定期稱量大鼠體質量及行胰腺病理學觀察，研究DMBA對大鼠胰腺的影響，探討小劑量DMBA誘導大鼠胰腺腫瘤動物模型的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與設備

SD大鼠，雄性，5周齡，體質量為180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號:SCXK(京)2012-0001;DMBA(Sigma公司，美國);10%(質量分數)水合氯醛溶液;10%(質量分數)甲醛溶液;石蠟包埋機，切片機(Leica公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

選擇70只SD大鼠，應用數字表法將大鼠進行完全隨機化分組，根據術中是否置入藥物分為實驗組和對照組，單籠喂養。實驗組(共60只):手術切開大鼠胰腺被膜，按2 mg/100 g劑量置入DMBA;對照組(共10只):僅行胰腺被膜的切開，不置入任何藥物。兩組大鼠術后每月稱量體質量，分別于術后2、4、6個月處死取材，并行胰腺病理學檢查。

1.2.2 模型制作

SD大鼠術前24 h電子秤稱量體質量后禁食，不禁水，選用10%(質量分數)水合氯醛溶液(3 mL/kg)進行腹腔內注射麻醉，麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于動物手術板，用紗布醮取0.9%(質量分數)氯化鈉注射液濕潤腹部被毛并剔除干凈，碘伏消毒。

每只大鼠均經上腹正中偏左約0.5 cm處作一縱行切口，長約2 cm，手術刀切開皮膚，剪刀剪開腹壁肌肉進入腹腔，用棉簽醮取0.9%(質量分數)氯化鈉注射液后翻轉胃體及脾臟，將胰腺充分暴露，濕紗布保護其他器官。實驗組大鼠用顯微鑷輕輕提起胰腺體尾部，于胰腺最厚處剪開被膜及部分胰腺實質，深入胰腺實質約2 mm，通過自制加藥匙按2 mg/100 g劑量置入DMBA，用6-0 Prolene縫合線縫合胰腺被膜，打結，距線結0.3 cm處剪斷縫合線，便于后期尋找藥物包埋位置。對照組大鼠僅作開關腹及剪開胰腺被膜，胰腺內不置入任何藥物。用濕棉簽復位腹腔各器官，3-0縫線連續縫合腹壁肌肉及皮膚。術后大鼠繼續飼養于普通級環境，飲食同術前。整個手術過程細致輕柔，注意不損傷其他組織、器官，肉眼觀察無DMBA晶體散落于腹腔。建模方法見參考文獻［3-4］。

1.2.3 病理學及免疫組化檢測

用10%(質量分數)水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉處死大鼠后，解剖暴露腹腔內各器官，尋找藥物包埋時所留的線結標志，取下藥物包埋位置胰腺組織及周圍胰腺組織，所有組織標本均放入10%(質量分數)甲醛溶液進行固定，固定時間為24 h，將固定好的胰腺組織進行取材，所取組織盡量為藥物包埋周圍組織，石蠟包埋時切面朝向下方，包埋過程迅速，盡量避免組織塊變涼、蠟液凝結或出現氣泡。行切片、HE染色觀察腫瘤組織特征，免疫組化檢查采用常規S-P法確定腫瘤來源。一抗 SMA、CD117、Ki-67、Desmin和CD34均為鼠抗人單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。二抗EnVision購自Dako公司。

1.3 統計學方法

使用SPSS 16.0進行統計學處理。計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較使用重復測量數據方差分析方法。計數資料用頻數和百分數表示，組間比較使用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物分組情況

實驗組大鼠異常死亡5只(8%，5/60)，其余順利完成實驗，死亡大鼠剔除實驗入組。對照組大鼠無異常死亡，均按計劃完成實驗。動物分組情況如表1。

表1 動物分組Tab.1 Numbers of rats in two groups

2.2 大鼠體質量變化

術后每個月稱量兩組大鼠體質量，數據顯示實驗組及對照組大鼠術后體質量逐漸增加。觀察存活到6個月的2組大鼠(實驗組18例，對照組3例)的體質量變化，差異無統計學意義(P=0.095)，詳見表2。

2.3 大體標本及病理學檢測

2.3.1 大體標本

實驗組術后2個月胰腺大體標本可見腸管擴張，胰腺水腫，沿線結尋找到藥物包埋位置，埋藥處胰腺組織較其他位置稍硬，可見術中所植入DMBA晶體，淡黃色，被胰腺組織包裹成團。術后4～6個月實驗組大鼠胰腺病理大體標本可見明顯結節，直徑約0.3 cm，結節質韌，有一定彈性，剖開結節有液體流出，囊壁灰白色，與胰腺組織明顯不同(圖1)。術后6個月實驗組1只大鼠解剖后可見血性腹水以及腹腔各器官粘連，左上腹部最為嚴重，胰腺置藥標記處可見橢圓形占位，質硬，切面呈灰白色、魚肉狀，診斷腫瘤可能性大(圖2)。對照組大鼠解剖后部分可見輕微粘連。

表2 術后存活到6個月的2組大鼠體質量變化Tab.2 The weight change of rats in two groups after operation in 6 months kg

圖1 胰腺囊腫(A)，囊腫被剖開(B)Fig.1 Pancreatic cyst(A)and cyst was cut(B)

圖2 平滑肌肉瘤(A)，肉瘤被剖開(B)Fig.2 The leiomyosarcoma of the pancreas(A)and leiomyosarcoma was cut(B)

2.3.2 病理學檢測

實驗組大鼠胰腺置入DMBA 2個月后呈胰腺炎改變，鏡下可見中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤，導管上皮增生(圖3A)。

4個月后大鼠鏡下可見胰腺組織多灶性壞死、部分組織退變、彌漫性纖維素樣壞死伴纖維化及灶狀鈣化、可見淋巴細胞浸潤，部分導管上皮修復性增生，未見明顯異形細胞，考慮胰腺囊腫(圖3B)。對照組大鼠鏡下表現基本為正常胰腺結構，未發現明顯異常組織學改變。

6個月后1只大鼠胰腺置藥標記處鏡下可見細胞異形，核分裂易見，可見多核巨細胞(圖4A、B)，免疫組化提示，Ki-67(10%+)，SMA(+)(圖 4C)，Desmin(+)(圖 4D)，CD34(-)，CD117(個別+)，考慮為平滑肌肉瘤。

實驗組大鼠術后4個月胰腺囊腫發生率為33.3%(6/18)，6個月胰腺囊腫發生率38.9%(7/18)，使用Fisher確切概率法比較術后4個月、6個月胰腺囊腫發生率差異無統計學意義(P=1.000)，6個月胰腺部位平滑肌肉瘤發生率為5.6%(1/18)，胰腺部位平滑肌肉瘤總發生率1.8%(1/55);無胰腺導管細胞癌發生。

圖3 實驗組大鼠術后2個月及4個月病理學檢查.Fig.3 Pancreatitis were observed after 2 and 4 months of operation in experiment group

圖4 實驗組大鼠術后6個月病理學檢查Fig.4 Pancreatitis were observed after 6 months of operation in experiment group

3 討論

DMBA是多環芳香烴類化合物，本身不具有致癌作用，但是在大鼠或小鼠體內的代謝產物會誘導胰腺產生PanIN和胰腺癌，機制是DMBA的代謝產物造成DNA損傷和染色體畸變，導致胰腺出現早期損害時就已經引起了K-RAS基因和P53抑癌基因突變，最終發展成為胰腺癌［5］。相較于其他胰腺癌模型，DMBA誘導的胰腺癌模型能夠更加精確的模擬PanIN的進展過程，這與人類胰腺癌的發展過程類似［6］。其次，DMBA可以促進炎性反應因子(IL-1、IL-12、IL-17、TNF-α)誘導癌癥發生，有助于研究炎性反應致癌作用的機制［7-8］。

國內外學者［9］用DMBA誘導大鼠胰腺癌模型成功，所用的劑量與時間各不相同，成瘤率波動在17% ～39%。有文獻［3-4，10-11］報道 DMBA 誘導大鼠產生胰腺癌的劑量從1～10 mg不等，時間需要1～9個月。在本研究中，筆者采用小劑量DMBA(2 mg/100 g)置入SD大鼠胰腺內的方法試圖建立胰腺癌動物模型，55只大鼠術后體質量增長曲線未見下降趨勢，病理學診斷顯示為急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺囊腫(23.6%，13/55)及平滑肌肉瘤(1.8%，1/55)。筆者系統的回顧了實驗的經過，并且查閱了更多的相關文獻，手術置入DMBA過程與國內外報道基本一致，但為什么沒誘導出胰腺癌?

Druckey提出的“總和學說”和Berenblum提出的“兩階段學說”關于劑量和時間因素的影響可以用來解釋致癌劑的誘癌機制?！翱偤蛯W說”認為單一致癌劑的特異性致癌效應是不可逆的，當實驗中置入胰腺內的DMBA劑量過小達不到致癌的閾值，可能會造成成瘤率過低或者成瘤時間過長，只有劑量達到致癌閾值時才有可能誘導成瘤。而“兩階段學說”認為腫瘤發生包括啟動階段和促進階段兩個相互聯系的階段，啟動階段指正常細胞在致癌劑作用下可能轉變為腫瘤的潛伏性(休眠的)瘤細胞，這是一個特異性且往往是不可逆的過程，其時間可能很短;促進階段是非特異性的過程，指潛伏性瘤細胞在一定條件下發展為具有一定生物學及形態學特征的腫瘤，但是在不具備一定的條件時，休眠的瘤細胞也只可能停留在第一個過程。因此DMBA既存在閾下致癌劑量的問題，也存在劑量過高導致動物短時間病死率增高的問題。在實驗組，為了降低DMBA對大鼠的毒性，降低實驗大鼠病死率，同時減少DMBA散落入腹腔的概率，筆者置入大鼠胰腺的DMBA的量為2 mg/100 g，低于國內外類似實驗使用量，導致潛伏期長于動物本身壽命，未誘發出腫瘤，也有可能只引起了“兩階段學說”中的啟動階段，使大鼠胰腺導管上皮產生了潛伏性的瘤細胞，但是并沒有進一步發展進入促進階段，最終沒有導致腫瘤的發生。結果在6個月內只誘導1例胰腺平滑肌肉瘤發生。

平滑肌肉瘤最常發生于胃腸道、腹膜后、尿道、子宮和軟組織，占肉瘤的2% ～9%，在所有胰腺惡性腫瘤里只占到 0.1%［12-14］。文獻［15］報道胰腺平滑肌肉瘤有可能起源于胰腺導管平滑肌，或者胰腺內的小血管壁。Tan等［3］采用DMBA 9 mg置入SD大鼠胰腺，3～5個月內誘導出17例胰腺導管腺癌和1例胰腺纖維肉瘤，胰腺癌發生率為48.7%。Taguchi等［16］將DMBA溶液注射入SD大鼠皮下，結果表明幼年SD大鼠肉瘤發生率高于成年SD大鼠，越高劑量的DMBA誘導肉瘤成功率越高。間葉干細胞具有分化成骨骼肌細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞的能力，研究［16-17］表明肉瘤早期變化主要包括非典型成纖維或間葉細胞增生和集聚、毛細血管不規則增生等表現，由于缺乏肉瘤癌前病變階段典型的形態學特點和特異性表型，目前并不能確定非典型間葉細胞的集聚可以誘導癌前病變發展為惡性腫瘤或僅僅轉為非典型再生病變。所以，本實驗筆者只發現了大鼠胰腺炎、胰腺囊腫和1例胰腺相應解剖部位的肉瘤，胰腺部位平滑肌肉瘤的來源及形成機制有待進一步研究。

致謝:感謝楊盈赤老師在造模及昌紅老師、石峰老師在病理診斷中給予的大力幫助。

［1］ Jimenez R E，Z'Graggen K，Hartwig W，et al.Immunohistochemical characterization of pancreatic tumors induced by dimethylbenzanthracene in rats［J］.Am J Pathol，1999，154(4):1223-1229.

［2］ Pan J J，Oh S H，Lee W C，et al.Bone marrow-derived progenitor cells could modulate pancreatic cancer tumorigenesis via peritumoral microenvironment in a rat model［J］.Oncol Res，2009，17(8):339-345.

［3］ Tan X G，Yang Z L，Yang L P，et al.Expression of DNA-repair proteins and their significance in pancreatic cancer and non-cancerous pancreatic tissues of Sprague-Dawley rats［J］.World J Surg Oncol，2014，12:32.

［4］ Guo J C，Li J，Yang Y C，et al.Oligonucleotide microarray identifies genes differentially expressed during tumorigenesis of DMBA-induced pancreatic cancer in rats［J］.PLoS One，2013，8(12):e82910.

［5］ Khalaileh A，Dreazen A，Khatib A，et al.Phosphorylation of ribosomal protein S6 attenuates DNA damage and tumor suppression during development of pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2013，73(6):1811-1820.

［6］ Kimura K，Satoh K，Kanno A，et al.Activation of Notch signaling in tumorigenesis of experimental pancreatic cancer induced by dimethylbenzanthracene in mice［J］.Cancer Sci，2007，98(2):155-162.

［7］ Sharma S D，Meeran S M，Katiyar N，et al.IL-12 deficiency suppresses 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced skin tumor development in 7，12-dimethylbenz(a)anthracene-initiated mouse skin through inhibition of inflammation［J］.Carcinogenesis，2009，30(11):1970-1977.

［8］ Z'Graggen K，Warshaw A L，Werner J，et al.Promoting effect of a high-fat/high-protein diet in DMBA-induced ductal pancreatic cancer in rats［J］.Ann Surg，2001，233(5):688-695.

［9］ Zhu Z，Liu T，Han F，et al.Mutations in the p16 gene in DMBA-induced pancreatic intraepithelial neoplasia and pancreatic cancer in rats［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2015，14(2):208-214.

［10］Wang L，Liu H L，Li Y，et al.Proteomic analysis of pancreatic intraepithelial neoplasia and pancreatic carcinoma in rat models［J］.World J Gastroenterol，2011，17(11):1434-1441.

［11］ Wendt L R，Osvaldt A B，Bersch V P，et al.Pancreatic intraepithelial neoplasia and ductal adenocarcinoma induced by DMBA in mice:effects of alcohol and caffeine［J］.Acta Cir Bras，2007，22(3):202-209.

［12］Kocakoc E，Havan N，Bilgin M，et al.Primary pancreatic leiomyosarcoma［J］.Iran J Radiol，2014，11(2):e4880.

［13］舒紅，申敬偉，孫巖.原發性腹膜后平滑肌肉瘤十次轉移病灶手術病例分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(15):1191-1192.

［14］宋志文，陳永霞，曲林濤.原發性腹膜后腫瘤MR-DWI診斷價值的探討［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(12):946-947.

［15］ Xu J，Zhang T，Wang T，et al.Clinical characteristics and prognosis of primary leiomyo-sarcoma of the pancreas:a systematic review［J］.World J Surg Oncol，2013，11:290.

［16］Taguchi S，Kuriwaki K，Souda M，et al.Induction of sarcomas by a single subcutaneous injection of 7，12-dimethylbenz(a)anthracene into neonatal male Sprague-Dawley rats:histo-pathological and immunohistochemical analyses［J］.Toxicol Pathol，2006，34(4):336-347.

［17］ Tholpady S S，Katz A J，Ogle R C.Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro［J］.Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol，2003，272(1):398-402.