沉默SOCS1及負(fù)載MAGE－A3抗原的臍血樹突狀細(xì)胞殺傷腎癌細(xì)胞的研究

柴楓，王偉 （浙江蕭山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 杭州311201）

方勇 （浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 杭州310016）

魯廣，萬宇，張菡，林科佳，徐公林 （浙江蕭山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州311201）

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是重要的專職抗原遞呈細(xì)胞［1］，但是由于免疫逃逸及靶向性的問題，基于DC的腫瘤疫苗并未達(dá)到預(yù)期效果，因此迫切需要增強(qiáng)DC提呈抗原的能力從而提高效應(yīng)的靶向性。黑色素瘤相關(guān)抗原基因是1991年BOON實驗室首先鑒定發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MAGEA3在腎癌細(xì)胞株陽性表達(dá)率為100%，因此其被認(rèn)為是腎癌免疫治療研究中的理想靶抗原［2］。在DC介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，細(xì)胞因子信號抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）起著明顯的抑制作用，并且在維持自身耐受性和限制抗腫瘤免疫方面能起著非常關(guān)鍵性作用［3］。

本研究采用分子生物學(xué)RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）構(gòu)建沉默細(xì)胞因子信號抑制因子（SOCS1）的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人臍血來源的DC，再負(fù)載MAGE－A3抗原肽，增強(qiáng)DC對MAGE－A3抗原的遞呈能力，提高DC的靶向性，并觀察對腎癌細(xì)胞殺傷能力，為腎癌的免疫治療提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人腎癌細(xì)胞株購自中科院培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；10%胎牛血清購自杭州四季青生物材料研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco，GM－CSF、IL－4、TNF－α、IFN－γ購自美國Peprotech，Trizol購自美國Invitrogen；MAGE－A3多肽（購自上海和元生物），兔抗人SOCS1多克隆抗體購自英國Abcam，兔抗人β－actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自博士德生物，抗人CD83、CD86和HLA－DR抗體購自Santa Cruz生物技術(shù)公司，相關(guān)引物設(shè)計與合成委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，F(xiàn)ACsort流式細(xì)胞儀（BD，US）；GDS800分析系統(tǒng)軟件（UVP，US）。

1.2 DCs的體外培養(yǎng)

取足月妊娠分娩的健康產(chǎn)婦臍血50ml，采用密度梯度離心法分離收集人臍血單個核細(xì)胞（HUBMC），調(diào)整密度至5×106／ml，吸取2ml加于24孔板中，然后在37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，移去懸浮細(xì)胞，然后每孔加入 DCs培養(yǎng)基（含rhGM－CSF100ng／ml、rhIL－4 50ng／ml的RPMI－1640）2ml，隔天半量換液，誘導(dǎo)分化第10天采用慢病毒感染。

1.3 SOCS1－SiRNA載體構(gòu)建及病毒產(chǎn)生

依據(jù)GenBank，針對SOCS1序列設(shè)計的SiRNA寡核苷酸由上海和元生物有限公司提供并合成，共2 對 SiRNA 序 列， 序 列 1sense 5′－GACUGAUUC－CUAUUAAAUA－3′，antisense 5′－UAUUUAAUAGGA－AUCAGUC－3′；序列 2sense 5′－GCAUU－AACUGGGA－UGCCGUTT－3′，antisense 5′－ACGGCAUCCCAGUUA－AUGCTG－3′，直接連入酶切后的RNA干擾載體上，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，克隆后進(jìn)行鑒定，測序比對后陽性的克隆即為目的基因RNAi慢病毒載體，然后對病毒進(jìn)行包裝、純化及濃縮，陰性對照病毒滴度為2×109TU／ml，SOCS－1SiRNA病毒滴度為8×108TU／ml。

1.4 慢病毒感染樹突狀細(xì)胞

將DC誘導(dǎo)分化10d后分為4組：1組為空白對照，未感染任何病毒，2組感染陰性對照病毒（NC），3組感染慢病毒SOCS－1SiRNA－1，4組感染慢病毒SOCS－1SiRNA－2。基本操作步驟：感染前為細(xì)胞換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值50，每孔加入感染培養(yǎng)基和病毒共500μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Western－Blot檢測SOCS－1敲減率。

1.5 Western blot檢測SOCS1的表達(dá)

總蛋白抽提，每個樣品蛋白終濃度均調(diào)整為2g／L，上樣后經(jīng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1h，一抗（1∶200）4℃孵育過夜，二抗（1∶1000）室溫孵育2h，ECL顯色，X光顯影定影，用GDS800分析系統(tǒng)對Western－Blotting條帶進(jìn)行定量分析。

1.6 MAGE－3處理DC

慢病毒感染5d，將DC細(xì)胞分為4組：A組未處理DC組；B組為沉默SOCS1組；C組為未處理DC＋MAGE－A3多肽培養(yǎng)組，培養(yǎng)24h，加入TNF－α（50U／ml），繼續(xù)培養(yǎng)2d；D組為沉默SOCS1＋MAGE－A3多肽培養(yǎng)組。

1.7 DC分子表型檢測

將上述各組細(xì)胞液中分別加入FITC－CD83、PE－CD86、PE－HLA－DR，放置4℃環(huán)境中避光30min，采用1%多聚甲醛固定細(xì)胞，最終細(xì)胞液為500μl，然后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)情況，各試驗均設(shè)空白對照組。

1.8 DC誘導(dǎo)的CTL的殺傷效應(yīng)

實驗組中由DC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）稱為效應(yīng)細(xì)胞，以腎癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的比值分別設(shè)計為10∶1、20∶1和50∶1，嚴(yán)格參照MTT細(xì)胞毒性檢測試劑盒操作，依據(jù)公式計算出殺傷率：殺傷率（%）＝ ［（靶細(xì)胞A值＋效應(yīng)細(xì)胞A值－效靶混合細(xì)胞A值）／靶細(xì)胞A值］×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western blot實驗評估基因沉默效果

感染SOCS－1SiRNA慢病毒的DC，蛋白表達(dá)水平顯著低于感染陰性對照慢病毒的DC（NC）（P＜0.05），SOCS－SiRNA－1蛋白有效敲減率為52%，SOCS－SiRNA－2蛋白有效敲減率為74%（圖1）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍血DCs的表面標(biāo)志

DC成熟的主要標(biāo)志是CD83、CD86、HLA－DR等（見表1）。

2.3 T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性

各組DC對T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的影響，D組DC誘導(dǎo)的CTL對腎癌細(xì)胞的殺傷能力明顯高于其他各組（P＜0.05），并且隨效靶比的增高殺傷能力逐漸增強(qiáng)，效靶比50∶1時殺傷作用最強(qiáng)（見表2）。

圖1 SOCS1蛋白表達(dá)

表1 SOCS1－SiRNA轉(zhuǎn)染DC表面分子的變化

表2 CTL對靶細(xì)胞的殺傷率

3 討論

在腫瘤的生物治療中，以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗已成為目前臨床試驗研究的方向［4］，但由于DC自身的免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力，因此目前以DC為中心的大多數(shù)腫瘤疫苗治療效果欠佳［5］。干擾SOCS1表達(dá)可上調(diào)DC表面共刺激分子CD83、CD80、CD86的表達(dá)，增加促炎性細(xì)胞因子如：IL－l、IL－12、IFN－γ、IL－6和TNF－α的分泌量，進(jìn)一步激活CTL反應(yīng)。SOCS1－SiRNA修飾的DC能明顯提高免疫應(yīng)答［6］。

MAGEA3是MAGE A家族的一員，基因位于X染色體q28區(qū)，含有3個外顯子，蛋白質(zhì)為分子量48000的胞質(zhì)蛋白，由314個氨基酸組成，由于其在各種惡性腫瘤中都有不同程度表達(dá)，而在正常組織除睪丸和胎盤之外，和良性腫瘤中幾乎不表達(dá)1［6，7］，故MAGE抗原已成為特異性免疫治療選擇中的理想靶分子，目前，國內(nèi)外許多學(xué)者都對MAGE－A3基因在不同惡性腫瘤中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了深入研究［8］。有學(xué)者采用RT－PCR技術(shù)對10個腎癌細(xì)胞系中MAGE－A3基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，其陽性率為100%。因此，從理論上來說，由MAGE－A3抗原致敏DCs產(chǎn)生的CTL細(xì)胞，能夠?qū)δI癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用［9］。

在此項研究當(dāng)中，我們采用臍血來源的單個核細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增為樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)體系，采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建沉默細(xì)胞因子信號抑制因子（SOCS1）的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人臍血來源的DC，使之提呈抗原的能力顯著提高，再負(fù)載MAGE－A3抗原肽，以提高激對腎癌細(xì)胞殺傷能力。在此過程中我們選用了更有下調(diào)SOCS1作用的siRNA序列2進(jìn)一步實驗，結(jié)果表明D組中DC表面成熟分子標(biāo)志CD83、CD86和HLA－DR的表達(dá)明顯高于其它各組（P＜0.05），故由此推斷SOCS1在DC成熟的過程中發(fā)揮重要作用。在D組中對腎癌細(xì)胞的殺傷率顯著高于未致敏的DC誘導(dǎo)的CTL組，并隨著效靶比的增高而增強(qiáng)，從而為臨床上治療腎癌提供科學(xué)依據(jù)。

［1］Katz T，Avivi I，Benyamini N，et al.Dendritic cell cancer vaccines：from the bench to the bedside［J］.Rambam Maimonides Med J，2014，5（4）：e0024.

［2］Demirovic A，Dzombeta T，Tomas D，et al.Immunohistochemical expression of tumor antigens MAGE－A3／4and NY－ESO－1in renal oncocytoma and chromophobe renal cell carcinoma［J］.Pathol Res Pract，2010，206（10）：695～699.

［3］Diebold S S.Determination of T－cell fate by dendritic cells［J］.Immunol Cell Biol，2008，86（5）：389～397.

［4］Palucka K，Banchereau J.Cancer immunotherapy via dendritic cells ［J］.Nat Rev Cancer，2012，12（4）：265～277.

［5］Emens L A，Cancer vaccines：on the threshold of success［J］.Expert Opin Emerg Drugs，2008，13（2）：295～308.

［6］Demirovic A，Dombeta T，Tomas D.Immunohistochemical expression of tumor antigens MAGE－A3／4and NY－ESO－1in renal oncocytoma and chromophobe renal cell carcinoma ［J］.Pathol Res Pract，2010，206（10）：695～699.

［7］Chen X，He J，Chang L J.Alteration of T cell immunity by lentiviral transduction of human monocytederived dendritic cells［J］.Retrovirology，2004，1：37.

［8］Hong B，Ren W，Song X T，et al.Human suppressor of cytokine signaling 1controls immunostimulatory activity of monocytederived dendritic cells ［J］.Cancer Res，2009，69（20）：8076～8084.

［9］Negri D R，Michelini Z，Cara A.Toward integrase defective lentiviral vectors for genetic immunization ［J］.Curr HIV Res，2010，8（4）：274～281.