石油烴降解菌的分離及在含油污泥中的應用

姚力芬1 李 丹1 陳麗華2 李廣彬1 孫盼盼1 李佳釀3

（1．西北民族大學 化工學院，甘肅 蘭州，730030；2．西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州，730030；3．西北民族大學 電氣工程學院，甘肅 蘭州，730030）

近年來，石油污染的環境污染問題已越來越引起人們的廣泛關注，在治理石油污染的方法中，生物修復法因其獨特的優勢受到廣泛關注[1]。篩選出高效降解石油烴降解菌是生物修復的必然，目前有關石油降解菌方面的研究報道較多[2-3]。本文從甘肅隴東長慶油田中取得含油污泥，從中分離篩選得到六株降解石油烴菌株，并將其制得混合菌劑，同時進行了混合菌劑處理含油污泥的小試實驗，為以后的實際應用奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 含油污泥

試驗所用油泥采自甘肅隴東油區。油泥的TPH含量為50g/kg，含水率為25%，pH為7.82。

2 實驗方法

2.1 菌株分離

根據雒曉芳[4]等人的分離方法，取土樣2.5g，加入到有200mL無機鹽培養基的三角瓶中，在30℃，120r/min的恒溫搖床上進行振蕩培養7d，移取一定量的富集培養液接入新鮮降油培養基中，在相同條件下培養7d，相同操作共重復3次，經過3個周期的馴化后，在無菌條件下，用接種環蘸取馴化培養液，在降油培養基的平板上劃線后，平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養24～72h，然后將代表性較好的菌落在降油培養基平板上反復劃線純化得到單一菌落，再將純化的菌株接種至斜面保存培養基上培養后，保存于4℃冰箱中，待用。

2.2 菌株的鑒定

（1）常規鑒定：參照《微生物學實驗》[5]，對篩選得到的六株菌株進行了菌落特征及菌體形態特征觀察。

（2）生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》[6]首先將篩選出來的六株菌進行復活，在無菌條件下，分別各挑取少量菌加入生化管中，密封，放入35℃恒溫培養箱中培養24h后觀察現象，平行做兩組實驗。

2.3 混合菌劑的發酵

2.3.1 菌劑的復活

將營養瓊脂培養基配制好后，分裝于試管中，每支試管約4-5mL，后將所有所需儀器高壓滅菌，滅菌條件：121℃，20min，50℃保存。隨后在超凈臺上進行接種，接種完后在恒溫培養箱37℃培養24h，保存進行下一步工作。

2.3.2 一次擴培

將營養肉湯培養基配制好后，分裝于三角瓶中，每個三角瓶約10mL，后將所有所需儀器高壓滅菌，滅菌條件：121℃，20min，50℃保存。隨后在超凈臺上進行接種，接種完后在恒溫搖床培養箱37℃培養24h，保存進行下一步工作。

2.3.3 發酵

做好發酵罐的滅菌工作，然后進行接種，即倒入由a1、a2、a3、a4、a5、a6這六株菌（前三株所占體積百分數為50%，后三株為50%）按體積比為1:1:1:1:1:1配成菌懸液。

2.4 生長曲線的測定

按照文獻[5]，對于在發酵罐中進行發酵的混合菌劑，每三小時取樣一次，冷卻后放入冰箱，48h后統一用752型紫外可見分光光度計測定其OD值。

2.5 TPH降解率的測定

根據參考文獻[7]，土壤中石油類物質的測定采用紫外分光光度法。采用索式提取法提取土壤中石油類物質，利用紫外分光光度計測出相對應的吸光度，計算每千克干土中石油類物質含量，進而計算出石油類物質降解率 w：

其中w1： 為第1天土壤中石油類物質含量，mg/kg；mi為第i天土壤中石油類物質含量，mg/kg。紫外分光光度法測得原油的標準方程為：

其中：相關系數R2為0.5591。

為方便計算，將其轉變為250 mL樣品中所含的石油類總量和吸光度之間的關系式為：

其中：D為用250mL石油醚萃取含油土樣得到萃取液的有效吸光度，無量綱；M為樣品所含石油類污染物總量，mg。

2.6 微生物計數法

根據參考文獻[8]土壤中微生物數量測定采用平板菌落計數法。

2.7 實驗設計

本實驗的調節劑選擇的是容易取材的玉米秸稈，玉米秸稈提前粉碎備用，有機肥選用的是風干牛糞（C/N比為26，速效氮含量為1.7%），并按照油泥（濕重）與玉米秸稈的比例為98：2，油泥（濕重）與有機肥的比例為3：80的，含水率為50%來混合材料。

實驗設計兩個處理，實驗組和對照組，兩個處理均在室內同一條件下進行，底層鋪上防滲塑料布，將所有物料倒在塑料布上，攪拌均勻，堆置起來。同時在兩個堆體里加入發酵菌劑。上面覆蓋塑料薄膜，以保溫和保濕。中間插入通氣管，通氣管上每隔10cm打一個直徑為1cm的孔，通氣管外接通風設備，以在發酵過程中控制氧含量。在堆體上分別設置四個監測點，測量堆體溫度，并動態監測堆肥過程中堆體的PH、溫度等。當堆體的溫度經歷了升溫，高溫，降溫三個階段，并在溫度降低至40℃左右時，向實驗組堆體里按照5%的比例加入混合降油菌劑，25天時補加一次降油菌劑。對照組不添加菌劑。每7天采樣，測定實驗組和對照組微生物數量、脫氫酶活性及降油率的變化。

3 結果與討論

3.1 菌株的鑒定

3.1.1 常規鑒定

對篩選得到的六株菌株進行了菌落特征及菌體形態特征觀察，以下是各菌株的革蘭氏染色和簡單染色的效果圖示。

鏡檢結果如下圖1及表1所示：

表1 菌落的形狀、質地、顏色及形態

3.1.2 生理生化測試

首先將篩選出來的六株菌進行生理生化實驗，實驗結果如下表2所示。

表2 生理生化試驗鑒定結果

符號說明：“+”表示該項反應結果為陽性；“-”表示該項反應結果為陰性。

3.1.3 菌種鑒定結果

根據鏡檢和生理生化試驗結果對照，得到以下結果如表3所示。

表3 常規鑒定實驗結果

3.2 混合菌劑生長曲線的測定

根據圖2可知，混合菌在發酵開始時由于剛剛進入新的環境，開始時的0~3h菌體處于生長遲緩期，3~21h時間段內菌體迅速生長，處于對數生長期，21h時菌體吸光度值達到最大值為。21h后菌體生長趨勢開始進入穩定期，所以發酵菌劑時間選定為24h。

圖2 混合菌劑生長曲線

3.3 微生物數量與TPH降解率的變化關系

控制其他影響條件基本相同，如溫度、酸度、堿度、電導率、C/N、堆體的通氣情況，均在微生物的最適范圍子內。在不考慮其他變量的情況下，以是否加入石油烴降解菌劑作為唯一變量，討論對照組和實驗組微生物數量與降解幅度的關系。

由圖3可知，微生物的數量與降解幅度在總體上基本呈相關關系，因微生物數量較多時，石油烴類化合物被大量分解，降解幅度較大。堆肥0天時，在實驗組加入發酵菌劑和石油烴復合降解菌劑。此時，堆體的細菌數較多（約155×107個/g），微生物處于遲滯期，開始適應環境，不能適應環境的微生物會死亡，數量稍有降低。適應環境的微生物開始利用堆體中的有機物合成自身的細胞結構，遲滯末期，細胞個體變大，開始分裂。此時，細菌數雖稍有下降，但微生物數量仍較高，微生物利用石油作為能源進行新陳代謝，堆體中的石油烴類化合物被分解，降解幅度較大（約12%）。從第5天到第17天，微生物數量增長較快，達到最大340*107個/g，此時，微生物處于對數期，細菌利用堆體中的營養物質合成細胞結構大量繁殖，分解堆體中復雜有機物為較簡單的有機物。因堆體為牛糞，纖維素含量較高，有機質含量較低，一次發酵菌劑主要是分解纖維素為較簡單的糖類，利于降油菌劑分解。此時，堆體中的石油烴類化合物被微生物大量分解，降解幅度達到最大（35%左右）。

圖3 微生物數量與TPH降解率的關系

從第17天到24天，細菌數量開始下降，細菌開始進入穩定期，營養物質稱為主要的限制因素。此時，能被一次發酵菌劑降解的纖維素已基本被分解，其他營養物質含量也較低，細菌所需營養物質不夠，停止生長分裂，細胞內的有害代謝產物開始積累；當進入衰亡期時，細菌所需營養物質已消耗殆盡，細菌開始進入內源消耗，細胞內的有害代謝產物大量積累，影響細菌的生理活動，此時細菌開始死亡，微生物數量下降達到最低（約150×107個/g）。當微生物數量下降時，細菌的降解幅度開始下降，微生物數量達到最低時，降解幅度為負（約-12%），說明含油量相比上次增加，當微生物死亡時，部分石油烴類殘存在微生物殘體內，并未被分解，或是細菌的代謝物中含有短鏈的脂肪烴類物質，所以含油量增高，降解幅度為負。

從37天開始，對照組加入二次降解菌劑（六株高效降解石油烴類的復合菌劑），微生物數量又開始大幅度增加（達到400*107個/g），大量利用石油烴類化合物合成細胞自身結構，降解幅度達到隨之增加（達到18%）。此后，微生物數量開始逐漸降低趨于穩定，并逐步接近土壤本底值，降解幅度也趨于穩定。

對照組采用未加入降解菌劑的含油污泥和牛糞的堆肥實驗，控制所有變量與實驗組保持相同，由圖3可知，在堆體開始發酵時，堆體內的微生物也經歷適應期，對數期，穩定期和衰亡期，數量稍有變化，但由于對牛糞中的纖維素利用率較低，造成營養不足，難以大量降解石油烴類化合物，降解幅度幾乎不變（維持在4%左右）。

4 結論

本研究從被長期被原油污染污染的土壤中分離篩選方法篩選出6種降油菌（a1~a6），并通過常規鑒定和生理生化試驗，得到a1、a2、a3均為芽孢桿菌，a4、a6均為假單胞菌，a5為不動桿菌。通過細菌的復活，一次擴培，發酵操作，制得混合菌劑。

在實驗室中進行微生物修復石油污染土壤的小試實驗，結果表明，當土壤中石油含量為50g/kg時，加入混合菌劑的石油降解率比沒有加菌劑的降解效率高，添加5%菌劑81d的降解率為90.20%，均大于對照組（只添加有機肥）的降解率31.10%，說明了該混合菌劑具有應用于實際石油污染土壤生物修復的潛力。

[1] 商雪嬌,李思,張金輝.生物法處理含油污泥的研究進展[J].當代化工，2014，43（4）：622-624.

[2] 劉鵬,李大平,王曉梅,等.石油污染土壤的生物修復技術研究[J].化工環保，2006，26（2）：91-94．

[3] Belhaj A,Desnoues N,Elmer ich C.Alkane biodegradation in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a polluted zone:Identification of alkB and alkB-related genes[J].Res Microbiol，2002，153（6）：339-344.

[4] 雒曉芳,陳麗華,王冬梅,等.兩株降油菌株的分離及其降油特性[J].中國釀造，2012，31（10）：72-74.

[5] 沈萍,陳向東.微生物學實驗(第4版)[M].北京:高等教育出版社,2007.

[6] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社，2001.

[7] 陳麗華,馬金珠,雒曉芳,等.添加混合菌劑對石油污染土壤的降解[J].中南大學學報(自然科學版)，2012，43（11）：4581-4589.

[8] 李洪梅,郜玉環,江麗華,等.不同濃度石油烴對油菜產量、土壤中石油烴殘留量及土壤微生物的影響.中國農學通報，2010.26（17）：382-385．