氨氧化微生物在氮循環中的生態功能及其影響因子

朱國潔+張娜+杜雯+李曉鶴+王晨+王欣麗

摘 ? ?要：氨氧化作用是硝化作用的第一步，也是限速步驟，其主要驅動者是氨氧化細菌和古菌，在全球氮循環中發揮著極其的重要作用。本文主要介紹了氨氧化細菌和古菌的種類和系統發育，綜述了氨氧化細菌和古菌對硝化作用的相對貢獻和環境影響因子，最后提出了研究展望。

關鍵詞：氨氧化細菌;氨氧化古菌;堿性土壤;酸性土壤;環境因子

中圖分類號：Q938.1+1 ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.011

Ecological Function of Ammonia Oxidizing Microorganisms in the Nitrogen Cycle and Their Influence Factors

ZHU Guo-jie1 ， ZHANG Na2， DU Wen1， LI Xiao-he1， WANG Chen1， WANG Xin-li1

（1. College of Resources and Environment of Linyi University， Linyi，Shandong 276005， China; 2. Financial Department of Linyi University， Linyi，Shandong 276005， China）

Abstract： Ammonia oxidation is the first step in nitrification and the rate limiting step. The main driver are ammonia oxidizing bacteria and archaea， which play an important role in the global nitrogen cycle. This paper mainly introduced the types and the development of the ammonia oxidizing bacteria and archaea. The relative contributions of the ammonia oxidizing bacteria and archaea to nitrification and environmental impact factors were summarized. Finally， the research prospect was put forward.

Key words： ammonia oxidizing bacteria; ammonia oxidizing archaea; alkaline soil; acid soil; environmental factors

硝化作用在土壤氮轉化過程中是一個非常重要的步驟，它關系到外源銨態氮和礦化釋放的氮在土壤氮循環中的轉化以及土壤氮的損失。所涉及的過程關聯著土壤的酸化、水體的富營養化以及溫室氣體N2O的排放等環境問題[1]。因此，硝化作用一直是氮轉化過程中一個備受關注的環節。氨氧化作用是硝化作用的第一步反應，也是限速步驟[2]，其主要驅動者是氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA），因此對它們的研究引起了廣泛的關注。

1 系統發育地位

1.1 氨氧化細菌

氨氧化細菌普遍存在于土壤、地表水和沉積物中，還被發現在建筑沙石、蘇打以及南極冰層等一些極端的生態環境中也有存在。Woese等[3]基于16S rRNA結果比對發現，兩類在系統發育上明顯不同的類別組成了氨氧化細菌：一類是屬于變形菌門（Proteobacteria），包含海洋硝化球菌（Nitrosococcus oceanus）的γ-亞綱;另一類也是屬于變形菌門，包含活動硝化球菌（Nitrosococcus mobilis） 的β亞綱。變形菌門的β亞綱又包含3個分支：其一是Nitrosococcus mobilis;其二是歐洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaea）;其三是亞硝化螺旋菌（Nitrosospira） 、亞硝化葉菌（Nitrosovibrio） 和亞硝化弧菌（Nitrosolobus）。Head等[4]在基于16S rRNA的核苷酸序列對AOB的系統發育樹開展同源性比較時，將亞硝化弧菌、亞硝化螺旋菌亞和硝化葉菌都歸類到亞硝化螺旋菌屬。分子系統發生學分析表明，陸地生態系統中的優勢種群Nitrosospira和Nitrosomonas可以分成9個不同的系統發生簇（cluster）。

1.2 氨氧化古菌

在系統發育與進化方面，AOA形成了一類完全獨立于AOB的進化分支。基于16SrRNA基因系統發育分析表明，聚類在泉古菌的不同AOA分支其生態來源也不同：聚類于Group 1.1a的AOA來源于海洋、大部分水體和沉積物;聚類于Group 1.1b的AOA來源于土壤及其它陸地環境。基于amoA基因，在系統發育樹上嗜高溫AOA獨立于海洋和土壤分支。基于16S rRNA基因和AOA的amoA基因的系統發育分析結果顯示，二者能很好地重合。除此之外， Group 1.1c類群也被發現，并認為它們可能也參與了氨氧化過程，但目前還沒有找到相應的amoA序列[5]。

2 氨氧化微生物對土壤氮循環的相對貢獻

研究表明，雖然地球環境中存在大量的氨氧化古菌和氨氧化古菌的amoA基因，但并不說明該基因一定會在驅動氨氧化過程中發揮作用[6]。

2.1 氨氧化細菌在堿性土壤中的主導作用

在中性和堿性土壤中，施肥尤其是高量氮肥的施入，顯著改變了AOB的群落組成，并且數量也有增加，但對AOA卻沒有顯著影響。暗示AOB在這些土壤中更加“活躍”。Shen等[7] 對河南封丘長期定位試驗站中堿性潮土（pH=8.3～8.7）的研究中發現，不同施肥處理下AOB的數量均顯著低于AOA，但不同施肥處理僅導致AOB群落結構發生了變化，對AOA的群落組成并沒有產生明顯的影響，而且只有AOB的豐度與與土壤硝化潛勢呈顯著正相關。推測在這些堿性潮土中主要是AOB對土壤硝化作用產生貢獻。同樣地，在對新西蘭高氮草地土壤的研究中，Di等[8]也發現施氮肥增加了AOB的豐度和土壤的硝化強度，這種增加可被硝化抑制劑DCD明顯抑制，對AOA卻沒有明顯的影響。

利用DNA-SIP技術，Xia等[9]研究發現在河南封丘堿性潮土中，只有AOB參與了氨氧化過程和13CO2的固定，AOB在該土壤硝化作用中發揮了主導作用。Jia and Conrad[10]在對德國中性農田土壤進行研究時僅發現AOB能夠同化CO2，推測AOA可能并沒有參與土壤的硝化過程，或者因AOA只是利用了極少量的13CO2而沒能分離到足夠量的標記DNA，認為AOB是該土壤硝化作用的主要貢獻者。同樣，Jiang等[11]發現在堿性水稻土壤（pH=8.0）中硝化作用的主導者也是AOB（Nitrosospira Cluster 3）。Wang等[12]在對江西玉米地長期定位施肥土壤進行DNA-SIP研究時發現，不施肥對照、施N肥和NPK肥的土壤pH值為酸性，AOA在同化CO2的過程中占據了主導地位;而長期施有機肥的土壤pH值接近中性，主要是AOB參與了CO2的同化。

2.2 氨氧化古菌在酸性土壤中的主導作用

He等[13]通過對湖南祁陽旱地肥力及肥料效應長期定位試驗點紅壤的研究中發現，土壤pH值（pH= 3.7～5.8）因長期施用氮肥而顯著降低，在8個不同施肥處理中，AOB的數量均顯著低于AOA。不同施肥處理對土壤總細菌數量的影響并不明顯，但顯著影響了AOA和AOB的數量;而且AOB的群落組成在各處理之間沒有顯著差異，AOA的群落組成差異卻非常明顯[14]。這表明AOA的豐度和群落組成對長期施肥導致的土壤理化性質的變化所產生的響應比AOB更明顯。而且，AOB和AOA的豐度與土壤硝化潛勢呈顯著正相關，推測酸性土壤中AOB和AOA對土壤硝化作用可能都有貢獻。另有對我國南方酸性土壤中AOB和AOA群落組成調查的研究結果[15-16]也支持了這一推測。這些土壤中僅AOA的數量與土壤硝化潛勢呈正相關，與AOB的數量并沒有關系;而且茶園土壤中AOA與AOB的數量之比隨pH值的降低而增加。這些結果表明：在酸性土壤氨氧化作用中，AOA可能比AOB更加活躍。

應用基于DNA分析的穩定性同位素探針技術（DNA-SIP） ，Zhang等[17]根據氨氧化微生物氧化氨的同時固定CO2進行自養生長這一原理，加入13C標記的CO2作為底物對土壤（pH=3.7）進行培養，發現“活躍的”氨氧化微生物是AOA中的Group 1.1a-associated類群，在氨氧化過程中發揮了主導作用，同化了13CO2進行了生長，并且氨氧化速率與AOA的amoA基因豐度呈顯著正相關，但在AOB中沒有發現這種現象。另外，Lu等[18]的研究結果同樣表明Group 1.1a-associated類群是氨氧化作用的主要執行者。Wang等[19]在研究另一種酸性農田土壤時發現氨氧化作用的執行者是Group 1.1b類群。以上結果表明，氨氧化古菌主導了這些酸性土壤中的硝化作用。

AOA在酸性環境中發揮主要功能的可能機理包括[20]：（1） AOA對NH3的親和力更高[21]，因此，在低濃度NH3的環境中更容易生長。酸性土壤的pH值較低，其中的氨多以NH4+的形態存在，NH3濃度較低，更適于對NH3親和力較高的AOA生長。（2）很多研究表明，與無機氮相比，AOA的生長更易受有機氮的刺激，自養生長所利用的主要是有機質礦化所釋放的低濃度NH3。另外，AOA也可能是混合營養型生長，直接利用土壤中的有機碳源[22]。因此，AOA比AOB具有更大的競爭優勢。（3）AOA與AOB相比其生理生化和遺傳特征更加獨特，通過對幾株純培養的AOA基因組學的分析發現，AOA和AOB的氨氧化途徑可能顯著不同，而且AOA的氨氧化和碳固定過程能量的消耗明顯減少，有助于它們在一些不利的環境中發揮作用[23]。

酸性土壤中AOA占主導與堿性和中性土壤中AOB占主導的研究結果，支持了這樣一種猜測：兩類氨氧化微生物的生態位具有明顯的分化特征[24] 。即在中性和堿性土壤中，AOB發揮了功能活性;在低氮、強酸性和高溫等較苛刻的環境中AOA是硝化作用的主要驅動者。近來從英國蘇格蘭酸性土壤中成功富積培養到的一株嗜酸氨氧化古菌Nitrosotalea devanaterra，其適宜的生長pH值為4.0～5.0，當pH>5.5時生長受抑制[25]，更進一步證實了以上觀點。

3 環境因子對氨氧化微生物的影響

土壤擁有非常復雜的環境體系，其理化性狀決定著土壤中微生物群落的數量和分布。土壤氨氧化微生物的分布除了與土壤養分狀況緊密相關[26]，還與土壤pH值[27]、NH3濃度[28]、土壤管理方式[29]和植被[30]等有很大的關系。

3.1 pH值

硝化作用底物的生物可利用性和化學形態均受土壤pH值影響，同時pH值也影響AOB和AOA的生長和功能活性，進而影響它們對硝化作用的相對貢獻[31]。隨著農田土壤硝化作用的不斷加強，顯著降低了土壤的pH值，AOA的amoA豐度明顯下降，表明pH值可能是影響土壤AOA數量的重要環境因子[32]。另有研究表明，在pH=8.3～8.7的堿性土壤[33]和pH=3.7～6.0[34]的酸性土壤中AOA的amoA基因豐度與pH值也呈現較好的負相關。但是也有研究表明，AOA的amoA基因豐度隨著土壤pH值的升高而增加[35]，或者沒有顯著變化[36]。

Gubry-Rangin等[37]認為 pH值是唯一測量到的顯著影響AOA群落和結構的土壤理化性質。在酸性土壤中，相對豐度較高的AOB是Nitrosospira cluster 2[38];而Carnol等[39]證明，在高氮負荷的酸性褐色土壤中AOB的群落是以Nitrosomonas europaea為主。

一般認為，在pH值<6.5的環境中AOB不易生長，其適宜生長的pH值范圍為7.0～8.5。Yuan等[40]和Zhang等[41]的研究發現，在紅壤pH值比較低的條件下對氨氧化微生物的群落結構具有選擇性。另外，研究發現酸性和堿性土壤中氨氧化微生物的活性存在著明顯差異。He等認為在酸性紅壤中，氨氧化勢與AOA的豐度呈正相關，而與AOB的豐度無關;相反地，Shen等[7]在研究中性和堿性土壤時發現，氨氧化勢與AOB的豐度呈正相關。Hu等[42]通過高通量測序，認為pH值最能解釋AOA和AOB的生態位分異;Wang等[12]利用DNA-SIP技術，發現長期定位施肥改變了土壤的pH值，“活躍的”氨氧化微生物群體也發生了變化。

3.2 土壤中NH3的濃度

氨的氧化為緩慢生長的硝化微生物提供唯一的能量，因此氨介質的可利用性被認為是AOA和AOB不同生態分異的主要影響因素[43]。以前的研究表明，一些含氨量很低的生態系統中，也有未知的氨氧化微生物出現，因為原位條件下氨介質的濃度顯著低于AOB的生長需要[44]。同樣，在調查不施肥、施礦質肥和礦質肥加有機肥時，發現amoA基因拷貝數的AOA與AOB之比在不施肥土壤中最高[45]。研究表明，在大量施肥的土壤或者濕地中AOB豐度和硝化強度顯著正相關;而且AOA的生長受到高水平氨的抑制[46]。

在當前研究中從陸地或者海洋生態系統中培養或者富集古菌的抑制濃度是0.89～356 μmol·L-1，遠低于AOB的可培養濃度394～40 000 μmol·L-1。這表明AOA具有更低更窄的介質生長范圍。被富集的AOA的Km值僅為0.61～0.69[47]。相比較來說可培養AOB的Km常數是50～1 780 μmol·L-1，因此AOA具有更高的NH3親和力，大于可培養AOB的200多倍[48]。說明AOA在pH值較低的低氨環境中相比AOB有更大的競爭能力。

3.3 溫 度

合適的溫度對于生物酶催化新陳代謝非常關鍵，從而影響AOA和AOB的組成和活性等。Urakawa等[49]研究發現，較低的溫度會使AOB的數量和多樣性降低。Avrahami等人[50]發現，在中溫（10～25 ℃）時AOB的硝化潛勢最高，低溫（4 ℃）或高溫（37 ℃）時會顯著降低。在年平均氣溫差異非常明顯的土壤中，酸性土壤（pH=5.0～5.8）中AOB的物種組成有差異，優勢物種也不相同;弱堿性土壤中只有Nitrosospira cluster 3a隨溫度發生變化，且Cluster 3a只在高溫低肥的土壤中存在。在水簇箱過濾系統中，溫度較低時，AOA多樣性也低[49]。Tourna等[51]進行微生態系統培養試驗時，設計了不同的溫度（10～30 ℃，5 ℃為一梯度）梯度，對其進行DGGE群落結構分析后發現，AOA群落結構在不同培養溫度下差別較大。

3.4 通氣與水分條件

大部分的氨氧化微生物屬于好氧自養型微生物，需要在O2的參與下完成氧化NH4+產生ATP的過程。氧分壓與含水量呈負相關性，過低和過高的含水量對土壤硝化作用均有不利的影響。含水量高時土壤中氧氣含量低，對硝化微生物的代謝不利;含水量低時土壤中的氧氣可以完全充滿土壤，但干燥的土壤環境對硝化微生物的存活不利[52]。一般情況下認為，田間最大持水量（WHC）的 50%～70%為最適合硝化作用的土壤含水量[53]。在研究稻田土壤的硝化作用時發現：土壤的氧負壓決定著淹水土壤中硝化作用是否存在，硝化微生物能否繁殖和存活;在一定范圍內，硝化作用在低氧化還原電位條件下仍然可以進行;當硝化細菌的活性不被NH4+濃度所限制時，土壤硝化作用強度隨著淹水層O2濃度的增加而顯著增強[54]。稻田根際土壤與非根際土壤相比常常具有較高的氧化還原電勢， AOB的amoA基因數量在非根際土壤和根際土壤中變化不明顯，但是非根際土壤AOA amoA基因的拷貝數顯著低于根際土壤，AOA與AOB的amoA 基因比值在1. 2～69. 3的范圍內波動[55]。

4 結論與展望

氮循環過程中AOB和AOA的貢獻問題一直是該領域研究的重點，與生態因子的改變密切相關。利用同位素示蹤技術能準確定位AOB和AOA的生態功能，明確AOB和AOA在氨氧化作用中的相對貢獻，具有重要的生態環境和生物進化意義。今后應盡可能地分離、篩選不同生態環境條件下的氨氧化微生物，研究它們生理生態功能和生化特征，進一步深化對硝化作用機制的認識。另外，還應從大尺度上研究土壤氨氧化微生物群落分布和功能的特點，進一步明確其時空演變特征和驅動氨氧化微生物生態位分異的主要環境因子。除此之外，今后研究的重點還有評估氨氧化微生物在硝化過程中的作用，包括對溫室氣體N2O釋放的貢獻和其他可能的生態功能等。

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