響應曲面法優化超聲波提取白蒿總黃酮研究

劉永青+任琳+張子鋒+任瑞+于紅霞

摘 ? ?要：在單因素試驗的基礎上，利用曲面響應法對超聲波輔助纖維素酶提取呂梁白蒿總黃酮提取工藝參數進行優化研究。首先利用正交試驗優化纖維素酶解條件，然后選擇超聲波功率、超聲波時間和超聲波次數為自變量，總黃酮得率為響應值，采用Box-Behnken設計、Design Expert 7.0分析和二次回歸多項式預測策略優化超聲波條件。結果表明，超聲波輔助纖維素酶提取白蒿總黃酮最佳工藝條件為超聲波時間14 min，超聲波提取3次，超聲波功率396 W，酶解時間120 min，加酶量2.5%，酶解溫度50 ℃，酶解pH 值5.5，其中超聲波時間與次數的交互作用較強。白蒿總黃酮得率理論值為2.43%，實際值為2.47%。此方法優化呂梁白蒿中總黃酮提取效果良好。

關鍵詞：呂梁白蒿;總黃酮;纖維素酶;超聲波;響應曲面法

中圖分類號：R284.2 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.014

Ultrasonic Extraction of Flavonoids from Herb of Sievers Wormwood and its Optimization by Response Surface Method

LIU Yong-qing1， REN Lin1， ZHANG Zi-feng1， REN Rui2， YU Hong-xia1

（1.Luliang University， Luliang ， Shanxi 033000， China;2.Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu， Shanxi 030031， China）

Abstract： In this study， the response surface method on the base of single factor test was used to optimize the extract process of ultrasonic-assisted cellulase extraction of flavonoids from Luliang herb of sievers wormwood. After optimizing cellulase factors by the orthogonal experiment， the ultrasonic factors were studied with Box-Behnken design and polynomial quadratic equation predicting by Expert 7.0 analysis. The best solution was as follows： ultrasonic power 396 W， ultrasonic time 14 min， extracting 3times， 2.5% adding amount of enzyme， enzymolysis time of 120 min at 50 ℃ and pH 5.5. Under the optimized condition， the predicted and actual extraction rate of flavonoids were respectively 2.43% and 2.47%. Thereby the fitted multiple regression equation was credible.

Key words： Luliang herb of sievers wormwood; flavonoids; cellulase; ultrasonic; response surface methodology

白蒿（Herb of sievers wormwood）為菊科植物大籽蒿的幼嫩葉，又名茵陳。主要化學成分包括揮發油、多烯炔衍生物類、黃酮類、萜類化合物、微量香豆精和內酯類等[1]，其中黃酮類化合物具有抑菌、消炎、抗氧化等活性，可用作食品、化妝品行業的天然添加劑[2-3]。目前，從白蒿中提取黃酮類物質的工藝研究較少[4-6]，且常規方法提取總黃酮時間長，提取率低。纖維素酶可以高效酶解纖維素，加快黃酮類物質的溶出;超聲波通過強烈振動產生空化效應，加速活性成分提取。本研究采用超聲波輔助酶法技術提取呂梁白蒿中總黃酮，不僅能免去高溫對提取成分的影響，縮短提取時間，還能充分利用呂梁本土資源，為進一步開發呂梁白蒿提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

白蒿采自呂梁學院，烘干粉碎干燥后備用;纖維素酶購自南寧龐博生物工程有限公司，酶活力為10萬U·g-1;蘆丁標準品購自上海金穗生物科技有限公司;其他化學試劑均為國產分析純。

超聲波清洗機（SB-3200DTDN），寧波新芝生物科技股份有限公司;紫外可見分光光度計（UV-1601） ?北京瑞利分析儀器有限公司;微型高速萬能試樣粉碎機（FW80），北京中興偉業儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱（GZX-9146MBE），上海博訊實業有限公司醫療設備廠;數顯恒溫水浴鍋（HH-6），國華電器有限公司。

1.2 蘆丁標準曲線繪制

稱取蘆丁10.00 mg，用60%乙醇配制得0.1 mg·mL-1蘆丁標準溶液。分別量取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL上述蘆丁標準溶液，定容至15 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉、1 mL 10%的硝酸鋁、8 mL 4%的氫氧化鈉，搖勻放置10 min，510 nm波長處測定其吸光值[7]，繪制標準曲線。

1.3 酶法提取總黃酮條件優化及含量測定

稱取0.5 g白蒿粉末，溶于60%乙醇，加入纖維素酶搖勻酶解[8-9]，運用正交方法設計優化酶解條件，共選4個酶解因素，每個單因素選3個水平。單因素正交試驗水平設計見表1。

試驗結果按1.2方法測定吸光度值，按下列公式計算白蒿總黃酮得率[10]：

y=×100（1）

式中，y為白蒿的總黃酮得率（%）;m1為黃酮含量（mg）;m2為白蒿粉末質量（g）。

1.4 超聲波輔助酶法提取的單因素試驗

根據酶法優化結果，結合超聲波提取進行試驗。本試驗以白蒿中黃酮得率為指標，選擇超聲波功率、超聲波時間、超聲波次數作為試驗因素，進行單因素試驗，確定最佳超聲條件。

1.5 響應面分析試驗設計

以單因素試驗結果為依據，選擇對總黃酮得率有顯著影響的因素，運用Desigh Expert7.0軟件設計試驗[11-12]，并對試驗數據回歸分析。

2 結果與分析

2.1 繪制蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線見圖1。標準曲線回歸方程：Y=17.043X-0.018 6，相關系數R2 = 0.999 8，蘆丁濃度在0～0.024 mg·mL-1線性較好。

2.2 酶法提取白蒿總黃酮條件優化

對加酶量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH值進行正交試驗，方差分析見表2。結果表明，C與B高度顯著，其次為D、A，由此可確定各因素的最佳水平為A2、B2、C3、D1，最佳組合為A2B2C3D1。當酶解時間120 min，加酶量為2.5%，酶解溫度50 ℃，pH值為5.5時，該白蒿中總黃酮得率可達0.789%。

2.3 超聲波輔助法優化提取白蒿總黃酮單因素試驗

圖2為不同超聲波條件對黃酮得率的影響。當超聲波功率小于400 W時，黃酮得率隨超聲波功率的增加而提高，超聲波功率大于400 W時，黃酮得率逐漸下降，可能是過高功率破壞黃酮活性;黃酮得率隨超聲波時間延長而增加，當超過15 min時，黃銅得率開始降低，可能是提取出的黃酮隨時間延長部分分解所致;黃酮得率隨超聲波次數增加逐步提高，當超過3次時提高不大，從經濟和保護黃酮生物活性角度考慮，選擇超聲3次。通過單因素試驗，初步確定了各因素的最優提取條件：超聲波功率400 W，超聲波時間15 min，超聲波次數3次。

2.4 響應面分析設計方案與試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計方案，分別以超聲波功率、超聲波時間和超聲波次數作為獨立變量，-1、0、1分別表示變量水平。試驗因素水平及編碼表見表3，表中A、B、C為變量的編碼值，白蒿黃酮的提取率為響應值見表4，利用Design Expert 7.0軟件對數據進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：

Y=2.40-0.07A-0.15B-0.12C+0.014AB-0.055AC-0.14 BC-0.35 A2-0.25 B2-0.16 C2 ? ? ? ? ? ?（2）

該方程的顯著性檢驗結果見表5。

根據表5可知，整體數學模型P<0.01，失擬項為P>0.05，表明該方程對試驗擬合性好，可以用該模型來分析和預測白蒿總黃酮提取工藝。方差分析結果顯示模型中一次項B、C、交互項BC、二次項A2、B2、C2差異極顯著; 一次項A差異顯著;交互項AB、AC不顯著，表明各因素對黃酮提取率的影響不是簡單的線性關系。

根據回歸分析結果做響應曲面圖。當超聲波次數為3次時，超聲波功率與時間對黃酮得率的影響見圖3。當超聲波時間為15 min時，超聲波功率與次數對黃酮得率的影響見圖4;當超聲波功率為400 W時，超聲波時間與次數對黃酮得率的影響見圖5，黃酮得率隨超聲波功率和時間的增加先增大后減小，黃酮得率隨超聲波次數的增加而增大。

綜合上述分析結果，3個單因素對黃酮得率的影響大小為超聲波時間>超聲波次數>超聲波功率，且超聲波時間與超聲波次數之間交互性較明顯。軟件Design-Export7.0確定的最佳提取工藝條件為超聲波時間14.32 min，超聲波提取次數為2.72次，超聲波功率395.81 W，該條件下白蒿總黃酮的得率為2.43%。

2.5 驗 ?證

為了驗證響應面優化結果的可靠性，利用最佳優化條件進行試驗。為保證試驗可行性，按照超聲波功率396 W，超聲波時間14 min，超聲波提取3次的條件進行，重復3次取平均值，白蒿總黃酮的得率為2.47%，與預測值相差不大，可見該回歸方程的擬合性良好。

3 結論與討論

本試驗利用正交法結合響應面分析法，確定了提取呂梁白蒿中總黃酮的最佳條件為：超聲波時間14 min，超聲波提取3次，超聲波功率396 W，酶解時間120 min，加酶量2.5%，酶解溫度50 ℃，酶解pH值 5.5，其中超聲波時間與超聲波次數之間交互性較明顯。白蒿總黃酮得率理論值為2.43%，實際值為2.47%。說明此方法優化呂梁白蒿中總黃酮提取效果良好。

在白蒿粉末的制備過程中，發現許多絨狀纖維，當加入纖維素酶后發現總黃酮得率有較大提高。本研究通過4因素3水平正交試驗優化酶法提取條件，在此基礎上加入超聲波輔助提取工藝，并運用響應曲面優化超聲波條件。在為數不多的蒿類黃酮提取中[13-15]，超聲波提取工藝居多，而超聲波輔助酶法提取、響應曲面優化的工藝研究尚屬首例。該工藝提取黃酮類物質簡單、快速、效率高、破壞少，期望能為植物活性成分的進一步開發提供理論參考。

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