miR-103a-3p在胰腺癌細胞中的表達及意義*

賀軍 曹金敏 陳國棟 賀更生 凌暉

胰腺癌的發病率與死亡率基本接近，預后極差。胰腺癌臨床表現不典型，且具有浸潤侵襲生長的生物學特性，病程進展較快，大多數患者在診斷后1年內死亡，5年生存率<6%[1]。胰腺癌的早期浸潤轉移以及術后局部或全身極易出現復發轉移是胰腺癌致死的主要原因。隨著對腫瘤發生發展、侵襲轉移、治療、預后及耐藥等分子機制研究的深入，從基因水平闡述胰腺癌的發生發展及侵襲轉移，并通過基因治療胰腺癌可能是未來有效且安全的途徑。

miRNAs是一類僅有17～25 nt的小分子單鏈RNA，不編碼蛋白質，主要是通過與mRNA中3'非編碼區（3＇UTR）配對抑制或降解mRNA，在轉錄后發揮負性調控作用。miRNA不但在增殖凋亡、分泌代謝、生長發育等生理過程中發揮作用，而且在包括腫瘤在內的諸多疾病等病理過程中扮演重要角色。miRNA表達不但可抑制抑癌基因發揮致癌基因作用，亦可發揮抑癌基因起抑癌作用，且不同腫瘤、同一腫瘤不同時期表達miRNA種類及表達量均不一樣，在腫瘤發生發展中的各個調控過程發揮重要作用[2]。近年來研究發現miRNA中miR-103的異常表達可能參與胰腺癌的發生、發展[3-6]，但是對于其侵襲轉移的具體機制仍未闡明。本研究檢測不同侵襲性胰腺癌細胞株表達miR-103a-3p水平，進一步觀察表達抑制慢病毒載體轉染高表達miR-103a-3p的PANC-1胰腺癌細胞株后對其表達的抑制作用，為闡明胰腺癌的發病機制及篩選治療靶基因提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞株和質粒 人正常胰腺細胞系H6C7購自中山大學腫瘤防治研究中心，人胰腺癌細胞系PANC-1與BXPC-3購自上海中科院細胞所，慢病毒包裝細胞293T細胞購自上海Genechem基因公司。GV-159載體、輔助包裝載體pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體購自上海Genechem公司。

1.1.2 試劑和試劑盒 DMEM高糖培養基（美國Hyclone）、KSFM培養基（美國Life Technologies）、胰蛋白酶（北京Solarbio）、胎牛血清（美國Gibco）、rEGF、BPF（以色列ProSpec）RNA酶抑制劑（北京Solarbio）、Rnase inhibitor（北京天恩澤公司）、RNA marker（ 美 國 Sigma）、SYBR? PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit（TaKara公司）、慢病毒包裝試劑盒（上海 Genechem）、Lipofectamine 2000（ 美 國 Invitrogen）、質粒抽提試劑盒（德國Qiagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與RNA提取及濃度和完整性檢測PANC-1、BXPC-3采用含10%胎牛血清的DMEM培養，H6C7采用含細胞因子rEGF、BPF的KSFM培養基培養。取各對數生長期細胞，常規方法提取細胞總RNA，用分光光度計測定吸光值分析RNA純度。1.5%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-103a-3p的表達 按試劑盒說明書，采用SYBR? PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit檢 測 PANC-1、BXPC-3與 H6C7細胞的miRNA-103a-3p。引物序列：miR-103a-3p：CCATTGTACAGGGCTATGAAAA；U6（ 內 參 ）：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT。37 ℃、60 min下進行Poly（A）加尾、逆轉錄反應。PCR反應條件：95 ℃、5 s預變性；95 ℃變性60 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環。在熒光定量PCR儀上進行反應，待結束后用PCR儀自帶軟件進行分析，獲得產物CT值。各細胞組中miR-103a-3p相對表達量計算方法為：2-DDCt=癌細胞的（CtmiR-103a-3p-CtU6）-正常細胞的（CtmiR-103a-3p-CtU6）。

1.2.3 慢病毒載體的構建與包裝 合成hsa-miR-103a-3p-inhibitor引物序列：F：5’-AATTCAAAAAA GCAGCATTGTACAGGGCTATGA-3’，R：5’-CCGGTC ATAGCCCTGTACAATGCTGCTTTTTTG-3’，PCR 擴 增后，將產物克隆到慢病毒載體GV159上，構建慢病毒載體GV-159。同時設未進行任何序列加工的空殼病毒載體（吉凱基因公司構建的商業載體）作為慢病毒載體GV-159的陰性對照。將質粒抽提試劑盒提取的慢病毒包裝系統DNA溶液（含GV-159或空殼病毒載體，pHelper 1.0，pHelper 2.0）的稀釋液與Lipofectamine 2000 試劑的稀釋液混勻、溫育，制備DNA/Lipofectamine 2000稀釋液復合物，轉染293T細胞48 h后取含病毒顆粒上清液，離心獲取病毒濃縮液（miR-103a-3p-inhibitor病毒和空殼載體陰性對照病毒），熒光法測定病毒滴度。

1.2.4 穩定轉染細胞株的篩選與鑒定 接種高表達miR-103a-3p的PANC-1細胞，使其培養過夜后細胞融合度大約為50%，去除完全培養基，加入包裝的miR-103a-3p-inhibitor病毒或陰性對照病毒，使MOI（感染指數=病毒數/細胞數）=50，培養12 h后更換為完全培養基繼續培養，72 h后用倒置顯微鏡觀察GFP熒光，計算病毒對PANC-1細胞的感染效率。按上述方法進行qRT-PCR，鑒定穩定轉染細胞株中miR-103a-3p的表達。

1.3 統計學處理 實驗結果采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料均用（x-±s）表示，使用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各細胞株總RNA完整性分析 分別取胰腺癌細胞系PANC-1、BxPC-3和永生化正常胰腺細胞H6C7總RNA于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見28S、18S、5S三條帶，且28S的亮度為18S的兩倍，無其他雜帶（圖1），表明提取的總RNA質量好，可用于下一步實驗。

圖1 RNA完整性檢測電泳圖

2.2 各細胞株miR-103a-3p的表達 以正常胰腺細胞H6C7作為對照組，miR-103a-3p在PANC-1、BxPC-3和H6C7細胞中相對表達量分別為（4.949±0.130）、（1.417±0.120）、（1.010±0.151）， 兩 兩 組 間 比 較，差異均有統計學意義（P<0.05），miR-103a-3p在PANC-1表達量最高（圖2）。

圖2 miR-103a-3p在各細胞株中的相對表達量

2.3 miR-103a-3p-inhibitor慢病毒滴度 將收獲慢病毒液進行倍比稀釋（10、1、10-1μL）后分別感染293T細胞，3 d后熒光顯微鏡下1 μL病毒液基本上可將5×106/mL細胞全部感染（圖3），計算病毒原液病毒濃度約5×108TU/mL，此濃度可用于下一步慢病毒轉染實驗。

2.4 慢病毒感染PANC-1細胞株 慢病毒感染PANC-1細胞第4天，在熒光顯微鏡下可見miR-103a-3p-inhibitor慢病毒感染組（命名為Control-PANC-1組）和陰性對照慢病毒感染組（命名為NCPANC-1組）中報告基因GFP表達強度高，在細胞胞漿中聚集成團塊狀，在未感染空白對照組中未見熒光表達（圖4）。

圖 3 病毒滴度測定（100倍）

圖4 慢病毒轉染PANC-1熒光細胞圖（200倍）

2.5 慢病毒轉染細胞后qRT-PCR檢測miR-103a-3p相對表達量 以胰腺癌細胞PANC-1作為對照組，未轉染PANC-1組相對表達量（1.002±0.160）與NC-PANC-1組（0.956±0.250）相比，無明顯差異（P>0.05），而 Control-PANC-1組（0.317±0.320）分別與NC-PANC-1組相比，其表達量顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）（圖5）。

圖5 miR-103a-3p在未轉染及轉染PANC-1細胞相對表達量

3 討論

miRNA在腫瘤的發生進展、侵襲轉移、診斷預后、耐藥以及評估治療反應等方面起重要作用。隨著miRNA深入研究，越來越多的信息提示miRNA為胰腺癌的診斷、治療以及判斷預后提供一個新的進展方向[7-12]。

miR-103作為miRNA家族中的一員，包括miR-103-1和miR-103-2，位于泛酰酸激酶（PANK）家族中兩個成員PANK3 和PANK2的內含子區域。鑒于目前的理論基礎以及胰腺癌組織芯片結果中miR-103異常高表達，筆者推測miR-103a-3p在胰腺癌的發生發展及侵襲轉移過程中發揮一定作用。本研究選擇兩株侵襲能力高低不同的胰腺癌細胞株（PANC-1>BxPC-3）和一株永生化正常胰腺細胞（H6C7）作為研究對象，因這些細胞株在相關研究中比較深入且被文獻[13-14]認可。

miR-103在卵巢癌、乳腺癌中高表達，在惡性間皮瘤中低表達，能促進腫瘤細胞增殖及有助于腫瘤的診斷，胰腺癌組織中的miR-103高表達與其他miRNA聯合檢測有助于胰腺癌的診斷[15-17]。本研究應用qRTPCR檢測發現，胰腺癌細胞中的表達量明顯要高于正常胰腺細胞，與相關研究中胰腺癌組織中高表達結果一致，這也初步證實了miR-103a-3p表達上調與胰腺癌的發生具有一定的關聯[10]。miR-103與腫瘤的相關生物學進展密切相關，miR-103在子宮內膜癌、食管癌、結腸癌中高表達，與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關，并可影響患者的預后[18-20]。本實驗發現三株細胞中miR-103a-3p均有一定量表達，相對正常胰腺細胞H6C7來說，侵襲力較強的PANC-1細胞中表達最高，提示miR-103a-3p可能參與胰腺癌的發生發展。

Moncini等[21]在利用miR-103 的反義寡核苷酸和siRNA載體能降低治療人類神經母細胞瘤中miR-103的表達，且能使該腫瘤細胞侵襲的能力降低很多，從而阻止腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移。燕海嬌[22]利用慢病毒介導microRNA-20a過表達后能抑制胰腺癌細胞的增殖以及侵襲轉移。本研究中將抑制miR-103a-3p表達的特異性載體進行慢病毒包裝并感染高表達miR-103a-3p的PANC-1細胞，發現轉染miR-103a-3p抑制表達的慢病毒后的細胞中miR-103a-3p表達水平顯著下降，進一步提示miR-103a-3p可能參與促進胰腺癌的進展，并可能作為胰腺癌治療的靶位。

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