硝酸纖維素膜的再生處理及其吸附蛋白能力的研究*

李福剛

[文章編號] 1672-8270(2015)09-0014-04 [中圖分類號] R392.33 [文獻標識碼] A

硝酸纖維素膜的再生處理及其吸附蛋白能力的研究*

李福剛①*

[文章編號] 1672-8270(2015)09-0014-04 [中圖分類號] R392.33 [文獻標識碼] A

目的：解決硝酸纖維素膜老化在金標斑點定性或定量滲濾試驗檢測系統中帶來的檢測結果不準確的問題。方法：以兩項膠體金斑點免疫滲濾試驗——結核分枝桿菌抗體膠體金法定性檢測(TB-DOT)和人絨毛膜促性腺激素金標法定量檢測(HCG-DOT)為研究模式，對比3-甲基-1-丁醇處理前后的老化膜與正常膜的呈色結果、流速、吸附能力及穩定性等。結果：實驗數據證實，處理后的硝酸纖維素膜流速提高14.4%，吸附能力明顯增強，變異系數(CV)值均小于未處理的膜，穩定性良好，與新膜保持一致，表明再生處理的方法能夠在一定程度上改善膜的性能。結論：本研究所使用的方法，不但解決了膠體金快速定量免疫化驗測定試劑盒在生產中遇到的膜老化問題，也保證了產品在臨床應用中具有更好的準確性。該解決方法具有一定普遍意義，同樣適用于即時檢驗(POCT)類其他使用硝酸纖維素膜的診斷產品。

硝酸纖維素膜；再生處理；吸附能力

[First-author’s address] Shanghai Upper Bio-Tech Pharma Co. Ltd. Shanghai 201201, China.

在金標斑點定性或定量滲濾試驗檢測系統中，用于固相抗原或抗體的硝酸纖維素膜的質量優劣和穩定性是影響檢測結果的重要因素，入庫時質量好的硝酸纖維素膜往往因老化而影響其原有的質量和穩定性[1-9]。快速的金標法結核定性檢測(TB-DOT)及金標法HCG定量測定(HCG-DOT)是一種免疫膠體金滲濾試臉，屬即時檢測(point of care testing，POCT)范疇，數分鐘可測得結果[10-12]。但在產品大規模的生產過程中，會有部分硝酸纖維素膜由于溫度、濕度及效期等綜合原因而出現老化現象，導致產品在臨床應用中出現檢測結果不準確的現象[13-14]。如果遇到巳有老化現象或有老化傾向的膜，可采取各種再生處理措施，以保證質量，繼續用于生產，確保生產不間斷，同時可使原材料不浪費。使用3-甲基-1-丁醇處理老化的硝酸纖維素膜是文獻中報導過的再生方法[15]。為此，本研究將3-甲基-1-丁醇處理前、后的硝酸纖維素膜與正常膜進行實驗對比，在此基礎上尋找出大規模生產中可行的處理方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

存放多年、巳呈老化現象的硝酸纖維素膜及新購合格對照批次硝酸纖維素膜，其孔徑均為0.45 μm，均購自美國通用電氣公司；3-甲基-1-丁醇購自Sigma公司；HCG單抗購自Medix公司；HCG-DOT試劑盒、TB-DOT試劑盒及U2金標斑點法定量讀數儀均購自上海奧普生物醫藥有限公司。

1.2 硝酸纖維素膜再生處理方法

配置濃度為1%的3-甲基異丁醇溶液200 ml，置于恒溫水箱中加熱到60 ℃，取老化硝酸纖維素膜，浸泡于溶液中維持15 min，取出后用純水洗滌5遍，然后在8%的甘油溶液中浸泡30 min，再用濾紙擠壓處理后的膜，去除多余的甘油，涼干后置于塑封袋中室溫保存備用。

1.3 試驗方法

分別采用未處理和處理過的已老化的硝酸纖維素膜按照上海奧普生物醫藥有限公司生產工藝規程，制備HCG-DOT反應板和TB-DOT反應板，制備流程如圖1所示。

圖1 HCG-DOT反應板制備流程圖

將正常生產檢驗合格的試劑盒中的反應板作為對照，并將以上3種反應板分別與合格試劑盒中的配套試劑組合進行測試，測試操作流程參照試劑說明書，比較未處理、再生處理以及對照試劑盒的各項性能指標。未處理硝酸纖維素膜制備反應板為觀察A組，處理過硝酸纖維素膜制備反應板為觀察B組，正常生產檢驗合格的試劑盒中反應板為對照組。

2 結果

2.1 流速比較

取3組反應板塊，分別在板中加入850 μl水，用秒表計時，觀察水全部滲入所用的時間，整卷膜分成6個區域，每個區域取樣兩點，計算12個點的流速均值和變異系數(coefficient variation，CV)值(如圖2所示)。

圖2 流速比較示圖

圖2 顯示，硝纖膜經3-甲基-1-丁醇處理再生后其滲濾速度有所提高，較處理前提升14.4%，提示其浸潤性大幅改善。同時，處理后的流速CV值較未處理的低8.76%，與對照組接近，表明處理后膜的均一性有很大改進。

2.2 吸附能力比較

取3組TB-DOT反應板，通過觀察其斑點顯色情況來判斷處理后膜對TB抗原的吸附能力，結果見表1。

實驗結果顯示，處理后的硝酸纖維素膜在溶液的浸潤性方面要明顯好于未處理膜，處理后膜陽性呈色斑點顏色也略深，尤其在濃度較低時，提高了反應的靈敏度，表明其蛋白吸附能力確實有增強，避免了低濃度陽性標本誤判為陰性的情況發生。同樣，在反應板上依次滴加2滴封閉液，6滴洗滌液，100 μl金標液，不加樣品或陰性與陽性對照，以直接觀察膜對質控點包被蛋白的吸附能力。質控點包被蛋白是純化的羊抗人IgG，其被吸附在膜上后即便不捕獲人樣品中的IgG，也能與紅色膠體金綴合物反應，因為綴合膠體金的葡萄球菌A蛋白能與羊IgG結合。發現處理后的質控點顏色較處理前略深，表明固定在膜上的羊IgG較未處理的多，與膠體金顆粒結合量大，故顏色略深，形狀較均勻。實驗結果顯示，觀察A組質控點顏色較淺，顯色會出現空斑，觀察B組與對照組表現一致，顏色較深，形狀圓潤，色澤均勻。

取3組HCG-DOT反應板，每組分別測試3個濃度質控品和非懷孕婦女血清，每個濃度測試10次，計算均值和CV值，通過觀察斑點在儀器上的測試結果來判斷處理后硝酸纖維素膜對HCG單抗吸附能力，其結果見表2。

表1 TB抗原吸附能力比較

表2 HCG單抗吸附能力比較

表3 TB抗原加速穩定性比較(37 ℃放置10 d)

表4 HCG單抗穩定性比較(37 ℃放置10 d)

表2顯示，用處理后的硝酸纖維素膜所測得的值高于未處理的膜。其中200 mIU/ml高出8%，1000 mIU/ ml高出29%，10000 mIU/ml高出7%。從定量的HCGDOT角度比對，表明經醇的處理后老化的硝酸纖維素膜可以再生，其吸附蛋白能力有所增強。且CV與未處理的相比較低，與對照組結果相一致，表明處理后精密度好，重復性高，能改進膜的均一性。故膜對HCG單抗吸附能力越好，在相同條件下測定結果越高。

2.3 穩定性比較

取3組TB-DOT反應板，通過37 ℃加速試驗觀察其斑點顯色情況來判斷處理后硝酸纖維素膜上TB抗原的穩定性，其結果見表3。

表3結果與表1相比較發現，處理后硝酸纖維素膜顏色的變化與10 d前相比基本一致，穩定性很好。處理后硝酸纖維素膜用于TB-DOT試劑盒，37 ℃放置10 d后的質控點顏色與10 d前接近，形狀均勻，無空斑，且與對照組相同。

取3組HCG-DOT反應板，每組分別測試3個濃度質量控制品，每個濃度測試10次，計算均值和CV，通過37 ℃加速試驗(10 d)觀察其斑點在儀器上的測試結果來判斷處理后膜上HCG單抗的穩定性，與10 d前各濃度的平均值及CV值作對比發現，10 d后處理前后各濃度的測試值均略有變化，但幅度甚微。處理過的硝酸纖維素膜在200 mIU/ml、1000 mIU/ml及10000 mIU/ml分別升高1.6%、4.3%及降低0.1%，與處理后4 ℃比較以及對照組膜37 ℃放置10 d相比較變化幅度均不顯著(見表4)。

HCG單抗穩定性比較，10 d前、后TB抗原、HCG單抗的反應情況顯示，處理后的膜吸附性能良好，效價未降低，能保證相當的穩定性，不會影響反應結果。

3 結論

結合生產中遇到的不同程度老化硝酸纖維素膜的實際情況，采取整體再生處理的方法，綜合對處理前后硝酸纖維素膜的流速、均一性、吸附能力、穩定性以及質控點的比較，可以看到經3-甲基-1-丁醇的再生處理后，流速提升14.4%，吸附能力明顯增強，穩定性保持良好，且CV值均小于未處理的，與正常的新購膜各種指標相一致。表明再生處理的方法確實能在一定程度上改善膜的性能。由于醇類能夠減少溶液的表面張力和降低靜電斥力來顯著提高膜的浸潤性和穩定性，因此處理后的膜其浸潤性要好于未處理的；加入少量的醇能降低蛋白在溶液中的穩定性，而蛋白在包被時穩定性差反而在膜上容易固相被吸附，少量醇的添加不會導致蛋白質的變性或沉淀，可以促進蛋白質在硝酸纖維素膜上的被吸附。濃度極低的醇的存在會促進蛋白的固定，保證了硝酸纖維素膜的穩定性。

通過對不同老化狀況的硝酸纖維素膜采取整體再生處理方法，既可以保證產品的質量又節省了成本，提高了膜的利用率。通過課題研究，基本解決了膠體金快速定量免疫化驗測定試劑盒在批量生產中遇到的硝酸纖維素膜老化問題，這些生產中應急的解決方法具有一定普遍意義，不僅局限在TB-DOT和HCGDOT的生產控制上，還適用于POCT類其他快速金標診斷產品，不但解決了企業生產中的主要原材料老化問題，也保證了產品在臨床應用中具有更好的準確性。

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Study on protein adsorption ability and the regeneration of nitrocellulose membrane/LI Fu-gang// China Medical Equipment,2015,12(9)∶14-17.

Objective∶ To solve the inaccurate results caused by the aging of nitrocellulose membranes in qualitative or quantitative immuno-colloidal gold infiltration tests. Methods∶Using qualitative TB-DOT and quantitative HCG-DOT immuno-colloidal gold filtration test systems, we compared the treated coloration, circulation velocity, adsorbing power and stability of nitrocellulose membrane of good quality, 3-methyl-1-butanol treated and untreated aged membranes. Results∶ Abundant results has approved that the regeneration of aged nitrocellulose membrane by 3-methyl-1-butanol treatment lead to 14.4% faster flow velocity, stronger absorption capability, better stability, and lower CV value, compared to untreated membranes. Conclusion∶ The mentioned method solves the problem caused by the aging of nitrocellulose membranes, and assures the accuracy of measurements. Furthermore, it is an universal solution that can be applied to other POCT products.

Nitrocellulose membrane; Regeneration; Absorption ability

李福剛,男,(1975- ),碩士，高級工程師。上海奧普生物醫藥有限公司總經理，從事體外診斷試劑研發管理工作。

2015-04-19

科技型中小企業技術創新基金(05C26213100490)“金標斑點法定量檢測系統技術平臺的產業化”

①上海奧普生物醫藥有限公司 上海 201201

*通訊作者：lfg@poct.cn

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.09.005