干旱脅迫下兩種委陵菜葉綠體超微結構及光合生理特性

郭 瑤，王 玲

(1.吉林建筑大學 城建學院，長春，130111;2.東北林業大學 園林學院，哈爾濱150040)

近年來，在全球氣候變化背景下干旱頻繁發生且日趨嚴重，大部分國家和地區都不同程度地受到干旱威脅［1］，干旱脅迫已成為限制植物正常生長發育及生理代謝的關鍵因素。

委陵菜(Potentilla chinensis)和翻白委陵菜(P.discolor)是薔薇科委陵菜屬的多年生宿根草本植物。委陵菜屬植物種類較多，約300余種，大多分布在北半球的寒帶、溫帶以及高山地區，我國有80余種，全國各地均有，但主要生長在東北、西北和西南地區［2］。委陵菜屬植物葉為指狀或羽狀復葉，花黃色、白色或紅色，瘦果多數，莖直立、上升或匍匐［3］。該屬植物抗逆性較強，具有較好的抗旱、抗寒性，還有良好的涵養水源、保持水土及護坡作用，植株也具有一定的觀賞性，已陸續的應用在城市園林綠化和景觀配置中，能夠起到獨特的綠化美化作用，并表現出了良好的適應性。當前，城市園林中所應用的委陵菜屬植物種類并不多，還有大量的資源可以被開發利用，值得去研究并推廣應用。目前對委陵菜屬植物的研究，主要集中在藥用價值、觀賞價值、花粉形態、抗旱性、引種馴化、資源開發利用、葉表皮形態等的研究［4－9］。本研究通過對不同水分脅迫程度下委陵菜和翻白委陵菜葉片超微結構以及光合生理特性的變化進行差異分析，為兩種植物適應干旱環境能力強弱的綜合評價提供更多的參考數據，也為委陵菜屬植物抗旱性評價提供基礎參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料培養及采集

試驗在東北林業大學苗圃中進行，播種、培養委陵菜和翻白委陵菜的一齡幼苗做為試驗材料。兩種委陵菜的野生種子于2010年8月采集自大慶草原，并于2011年3月開始播種，之后將幼苗移栽至高12cm、口徑為9cm的花盆中，保證每盆栽植1株幼苗，基質選用土和草炭比例為3∶1的草炭土，基質量為距離盆口2cm左右。將植株置于同一室內環境中，并保持良好的溫度、光照和通風條件，采取一致的養護栽培管理。

1.2 試驗處理及取樣

于2012年6月選取發育良好、長勢一致的植株進行水分處理。設對照組和處理組，采用稱重法控制水分。對照組維持正常的土壤含水量，使其土壤含水量保持在35%～40%之間;處理組則持續30d停止供水，試驗開始后每5d進行一次取樣，測定各干旱脅迫階段土壤含水量、葉片含水量、葉綠素含量和光合生理因子。當處理組土壤含水量在25%～30%(輕度干旱脅迫)、15%～20%(中度干旱脅迫)、5%～10%(重度干旱脅迫)時，進行植物取樣，觀察葉綠體超微結構，各試驗時間節點取樣均要求重復3次。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤含水量的測定

每次測定時分別取對照組和處理組的原狀土樣，所取土樣為距離盆口0～6cm的土層，重量10g左右。測量方法采用稱重法，將土樣放入105℃的烘箱內連續烘干8h，之后放入80℃的烘箱內24h，計算土壤含水量，計算公式如下:

土壤含水量(%)=(濕土質量－烘干后質量)/烘干后質量×100%

1.3.2 葉片相對含水量、葉綠素含量的測定

采用烘干稱重法［10］測定葉片含水量;葉綠素含量采用乙醇浸提法測定［11］。

1.3.3 葉片超顯微結構樣品的制備

取兩組植株中部位相同、大小相近的葉片，用刀片切取靠近葉片中脈的部位制備試驗樣品，樣品切成約為1 mm×1 mm的小塊，切下后迅速將其放入3%的戊二醛溶液中固定24 h以上，之后在磷酸緩沖液中漂洗20min并重復3次，于4℃條件下移至1%的鋨酸中固定4h，去離子水漂洗3次，每次20min;接下來一步是脫水，選用的脫水試劑是乙醇，最后用環氧樹脂812包埋。切片采用的超薄切片機型號為LKB－5型;經過醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染后;采用H7650型透射電鏡觀察并照相［12］。

每一土壤含水量下，隨機選取15個視野，用面積表示測量葉綠體的大小，每個視野的測量重復3次，取其平均值。

葉綠體變化率=(對照下大小—重度脅迫下大小)/對照下大小×100%

1.3.4 光合作用相關生理指標的測定

在天氣晴朗、無風條件下的9:00－11:00期間，采用LI－6400便攜式光合測定儀測定葉片凈光合速率(Pn，μmol·m－2·s－1)、蒸騰速率(Tr，mmol·m－2·s－1)、氣孔導度(Gs，mol·m－2·s－1)、胞間 CO2濃度(Ci，μmol·mol－1)，并計算水分利用率(WUE=Pn/Tr，μmol/mmol)。每一土壤含水量下，選取大小相似、生長良好的4片葉子，以自然光為光源進行測定，每次測量重復5次，并將測定的葉片做好標記。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下土壤含水量、葉片相對含水量和葉綠素含量的變化

2.1.1 干旱脅迫下土壤含水量的變化

從圖1可以看出，隨著干旱脅迫天數的增加，處理組的委陵菜和翻白委陵菜土壤含水量均呈現逐漸的減小的趨勢。脅迫第5d時兩種植物的土壤含水量均處于25%～30%之間，此時是輕度脅迫階段;脅迫進入到第10～15d階段時，土壤含水量在15%～20%范圍內，處于中度脅迫階段;當脅迫進入到第20～25d時，土壤含水量處在15%～20%之間，屬于重度脅迫階段。

圖1 干旱脅迫對土壤含水量的影響Fig.1 The impact of drought stress on water content of soil

2.1.2 干旱脅迫下葉片含水量的變化

逆境條件下植物葉片相對含水量可反映植物的保水能力，是標志植物水分狀況的重要指標［13］。由圖2可知，隨著水分脅迫天數的增加兩種植物的葉片含水量均呈現持續下降的趨勢，在脅迫的第5d～10d委陵菜下降的幅度最大，為21.53%;翻白委陵菜葉片含水量最大幅度的下降則出現在脅迫的第10d～15d，下降幅度為21.6%。脅迫末期時委陵菜和翻白委陵菜葉片含水量的下降幅度分別達到了78.8%、75.14%，委陵菜葉片含水量的下降幅度大于翻白委陵菜。

圖2 干旱脅迫對葉片含水量的影響Fig.2 The impact of drought stress on leaves relative water content

2.1.3 干旱脅迫下葉片葉綠素含量的變化

由圖3可知，兩種植物的葉綠素含量均隨著干旱脅迫的加重呈持續下降的趨勢。委陵菜和翻白委陵菜葉綠素含量最大幅度的下降分別出現在脅迫的第10d～15d和脅迫的第15d～20d。干旱脅迫30d后，同正常狀態相比委陵菜和翻白委陵菜葉綠素含量分別下降了56.9%、48.98%，表明受干旱脅迫后委陵菜葉綠素的含量低于翻白委陵菜。

圖3 干旱脅迫對葉片葉綠素含量的影響Fig.3 The impact of drought stress on Chlorophyll content

2.2 干旱脅迫下葉綠體超微結構及大小的變化

正常供水條件下，委陵菜和翻白委陵菜的葉肉細胞形態和葉綠體超微結構都基本一致。葉肉細胞結構完整、發育正常，葉綠體數量豐富，結構規則，大多呈長橢圓形，與細胞壁緊密結合并整齊單行排列。葉綠體內片層清晰可見，排列整齊有序，方向與葉綠體長軸基本平行，基質濃厚，可見淀粉粒和少量的嗜鋨顆粒(圖4－A，圖4－E)。此時，植物能夠進行正常的光合作用。

輕度干旱脅迫時，部分葉綠體體積變大，漸漸向細胞中央移動，不再與細胞壁緊貼，細胞壁厚度略有增加，少量類囊體片層結構不再是整齊排列開始變得扭曲、膨脹，嗜鋨顆粒變多。委陵菜葉綠體超微結構變化的程度要比翻白委陵菜明顯(圖4－B，圖4－F)。

中度脅迫時，葉片細胞壁明顯增厚，大部分葉綠體開始膨脹，由正常狀態下的長橢圓形變成了球形，葉綠體脫離了細胞壁，出現了質壁分離，外膜不再清晰。委陵菜葉綠體外膜局部出現了破裂，基粒片層排列松散、分辨不清且方向改變，類囊體變得腫脹，已有透明腔產生(圖4－C);翻白委陵菜的葉綠體結構同樣出現了擴張、分離、扭曲，但依然可以看到一些排列有序的片層結構(圖4－G)。

重度脅迫時，委陵菜葉綠體形態變得不規則，邊緣粗糙，被膜破裂，內含物外流，完全與質膜分離，片層結構排列紊亂，部分溶解，類囊體膜互相貼疊，嗜鋨顆粒膨大(圖4－D)。翻白委陵菜的葉綠體團聚在一起，發生了粘連現象，膜結構模糊不清，但少部分尚未破裂，基粒片層模糊不清，嗜鋨顆粒明顯增多(圖4－H)。

圖4 干旱脅迫對兩種委陵菜葉片葉綠體超微結構的影響Fig.4 Effect of drought stress on chloroplast in leaves of two Potentilla species

Ch，葉綠體;CW，細胞壁;GL，基粒;OG，嗜鋨顆粒

隨著干旱脅迫程度加重，葉綠體減小，且不同土壤含水量間差異顯著(P＜0.05)。委陵菜受重度干旱脅迫后葉綠體變化率為77.19%，而翻白委陵菜葉綠體的變化率為71.22%(表1，圖4)。

表1 干旱脅迫對兩種委陵菜葉綠體大小(μm2)的影響Tab 1 Effects of drought stress on chloroplast size of twoPotentilla species

2.3 干旱脅迫下各光合生理特性的變化

2.3.1 干旱脅迫下葉片凈光合速率、蒸騰速率和水分利用率的變化

水分脅迫會導致葉綠體光合機構的破壞，引起光合CO2同化效率的降低，使葉片光合速率降低［14］。在整個干旱脅迫過程中兩種委陵菜屬植物對照組的凈光合速率(Pn)變化不大，且一直維持在較高的水平。處理組則從脅迫開始Pn便呈現出逐漸下降的趨勢，在脅迫的第10～15d期間委陵菜Pn下降幅度最大，此時正處于輕度到中度脅迫的過渡期;翻白委陵菜Pn大幅下降出現在脅迫的第15～20d，此時脅迫處于中度到重度的過渡期。委陵菜Pn的下降幅度要大于翻白委陵菜，且相同脅迫天數翻白委陵菜的Pn都要高于委陵菜(圖5)。

對照組的蒸騰速率(Tr)一直相對平穩，保持在 5.7μmol·m－2·s－1至 6.4μmol·m－2·s－1之間;處理組隨著脅迫時間的延長，兩種委陵菜屬植物葉片的Tr則越來越小，Tr大幅度的下降均出現在脅迫的第10～15d期間，但脅迫過程中翻白委陵菜Tr的數值均高于委陵菜(圖5)。

水分利用效率(WUE)可以反映光合作用與蒸騰作用之間的關系，它提供了有關水分代謝功能的信息［15］。兩種植物對照組的WUE變化不大;處理組總體上呈先上升后下降的趨勢，委陵菜和翻白委陵菜WUE 的平均值分別為 1.46μmol·mmol－1和 1.49μmol·mmol－1，后者略高于前者(圖5)。

圖5 干旱脅迫對葉片凈光合速率、葉片蒸騰速率、水分利用率的影響Fig.5 Effect of drought stress on net photosynthetic rate，transpiration rate and WUE of leaf

2.3.2 干旱脅迫下葉片胞間CO2濃度、氣孔導度的變化

兩種植物對照組的葉片胞間CO2濃度(Ci)變化幅度不大，比較穩定。處理組中Ci的變化基本呈逐漸上升的趨勢，干旱脅迫的前10d委陵菜的Ci值同對照組差異不大，數值波動也很小，第10d之后開始明顯上升;翻白委陵菜則是在脅迫15d后開始與對照組形成明顯的差異，Ci值表現出大幅的升高(圖6)。

隨著干旱脅迫的加劇，兩種委陵菜屬植物氣孔導度(Gs)總體表現為下降的趨勢，Gs的下降均在第15～20d期間表現得最為顯著，脅迫開始后委陵菜的Gs基本上都小于翻白委陵菜(圖6)。

圖6 干旱脅迫對葉片胞間CO2濃度、氣孔導度的影響Fig.6 Effect of drought stress on Ci and stomata conductance of leaf

2.4 土壤含水量與各光合因子的相關性分析

由表2可見，土壤含水量同委陵菜和翻白委陵菜的Pn、Tr、Gs均呈極顯著正相關，同Ci呈極顯著負相關，其中同Pn的相關系數最大。說明土壤含水量與各光合因子間均存在一定的相關性，某一指標的改變都會對其它因子產生一定的影響。

表2 兩種委陵菜土壤含水量與光合指標間的相關性分析Tab 2 Correlation analysis between photosynthetic indexes and water

3 討論和結論

水分虧缺已經成為限制植物生長最普遍的非生物因素之一［16］。植物體直接暴露在環境中面積最大的器官是葉片，因此，當植物受到外界不良環境脅迫時，葉片最容易因適應環境而改變其自身的形態和結構［17－19］。在干旱脅迫下，植物細胞的超微結構會發生明顯的變化［20］，葉片細胞中葉綠體是對于干旱脅迫表現較為敏感并有著比較重要生理功能的細胞器。本研究對委陵菜和翻白委陵菜采取相同的干旱脅迫處理，通過葉片含水量、葉綠素含量、葉綠體大小變化率、葉綠體超微結構以及光合生理指標的變化來比較兩種植物耐旱能力的強弱。研究結果表明，兩種植物的抗旱能力為翻白委陵菜＞委陵菜。

葉片含水量可以反映植物體內水分的狀況以及葉片的保水能力;葉綠素含量的高低在很大程度上反映了某種植物葉片光合作用的強弱，并在一定程度上可以作為衡量葉片衰老的指標［21］。試驗還測定了葉綠體大小的變化率，它可以作為判斷和比較植物抵抗外界不良環境能力的依據。郁慧［22］、白志英［23］、張金政［24］、宋家壯［25］、初曉輝［26］分別對干旱脅迫下不同植物葉綠體結構受損程度、葉綠素含量進行研究，結果表明當植物受到相同程度的干旱脅迫時，葉綠體被破壞的程度越嚴重，植物的抗旱能力越弱。本研究中，受干旱脅迫后委陵菜的葉片含水量、葉綠素含量均比翻白委陵菜低，但葉綠體的變化率卻比翻白委陵菜大，表明受相同程度干旱脅迫時委陵菜葉綠體的受損程度更為嚴重。

葉綠素是植物進行光合作用的物質基礎，在光合作用中起著吸能和轉能的作用［27］。干旱脅迫條件下，氣孔導度與葉片蒸騰的強弱同步變化，隨著氣孔閉合數量的增加，植物的蒸騰作用相應的受到了抑制，光合速率也隨之下降［28］。葉綠體基粒和基粒片層數越多，基粒片層排列越致密，光合能力越強［29］。當葉綠體基粒片層和基質片層受到外界環境脅迫而破壞解體甚至消失時，會抑制光合作用的正常進行［28］。本研究表明，干旱脅迫開始后隨著土壤含水量的降低，葉綠體受損程度的加重，兩種植物的Pn、Tr和Gs均呈現逐漸下降的趨勢，Ci則在脅迫初期時有所下降，之后便一直處于不斷升高的趨勢。光合作用受氣孔和非氣孔因素影響，委陵菜屬的這兩種植物受到輕度干旱脅迫時，Ci都下降了，說明此時造成光合速率下降的主要因素是氣孔關閉;隨著脅迫程度的加重，光合速率仍然在不斷的減小，但Ci卻開始升高，表明此時光合速率的下降受非氣孔因素的限制。光合速率的減弱有一個從氣孔限制向葉肉細胞光合活性限制轉變的過程，也就是由氣孔限制因素向非氣孔因素轉變的過程，表現為光合器官活性的下降［30］。WUE是反映植物光合特性和蒸騰特性的綜合指標，用來說明植物消耗單位質量的水分能夠固定CO2的數量［31］，WUE若下降說明Pn下降的幅度要大于Tr，若升高則說明Tr下降的幅度要大于Pn。土壤含水量和光合因子相關性分析表明了干旱對于植物光合性能的影響。通過分析比較受干旱脅迫后兩種委陵菜光合性能的變化發現，兩者光合生理指標的變化趨勢基本一致，但脅迫天數相同時委陵菜葉綠體超微結構和各光合指標的變化基本都比翻白委陵菜顯著，各階段數值變化的幅度也基本大于翻白委陵菜，說明和翻白委陵菜相比委陵菜的抗旱能力相對較弱。

綜上所述，干旱脅迫條件相同時，對翻白委陵菜的影響要小于委陵菜，兩種植物均具有一定的抗旱能力，但委陵菜的抗旱能力比翻白委陵菜弱。葉片含水量、葉綠素含量、葉綠體超微結構和光合生理指標均可作為綜合評價不同委陵菜屬植物抗旱能力強弱的基礎參數，本研究結果可作為干旱地區綠化植物種類選擇的重要參考依據，還可為植物種類的抗旱性選育提供生理方面以及細胞學方面的資料。

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