小麥籽粒多酚氧化酶活性的QTL分析

趙勇,王杰,楊學芳,李曉云,張樹華,田紀春,楊學舉*

1.河北農業大學農學院/河北省作物種質資源實驗室,河北保定071000

2.河北農業大學生命科學學院,河北保定071000

3.山東農業大學農學院,山東泰安271018

小麥籽粒多酚氧化酶活性的QTL分析

趙勇1,王杰1,楊學芳1,李曉云1,張樹華2,田紀春3,楊學舉2*

1.河北農業大學農學院/河北省作物種質資源實驗室,河北保定071000

2.河北農業大學生命科學學院,河北保定071000

3.山東農業大學農學院,山東泰安271018

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是引起面團(片)顏色褐變的主要原因。由小麥品種花培3號和豫麥57雜交獲得DH群體168個株系，種植于2年6個環境中，利用324個多態性標記構建遺傳連鎖圖譜，對小麥多酚氧化酶活性進行QTL分析。利用完全區間作圖法，共檢測到15個加性效應位點，其中2D染色體上主效QTL（標記Xcfd168-Xbarc349.2）在4個環境下均能被檢測到，貢獻率為11.65%～65.84%，適用于分子標記輔助育種。

小麥;多酚氧化酶(PPO);QTL分析

面制食品是我國人民的傳統主食，在人們的膳食結構中占有非常重要的地位，我國居民在制作面制食品時對面粉白度有較高要求，細膩潔白的面粉及其制品備受消費者青睞。小麥籽粒中的多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，簡稱PPO)活性及其相應的底物是導致酶促褐變的主要原因，可解釋面條、水餃、饅頭等面制半成品顏色變異的55～70%[1-5]。環境和基因型都影響PPO的活性，但PPO活性主要受基因型影響，不同品種間PPO活性相差很大，因此，通過遺傳育種途徑改良面制品顏色的褐變是可行的[6]。

Jimenz等[7]通過對代換系PPO活性的測定，推測控制小麥PPO主效基因為1～2個，同時指出針對PPO底物的專化性存在多個等位基因。葛秀秀等[8]應用植物數量性狀基因+多基因混合遺傳模型對中國冬小麥PPO活性的遺傳分析表明，PPO活性受2對獨立主基因控制。Udall等[9]和Demekes等[10]利用RFLP標記以重組近交系群體為材料，Mares等[11]利用AFLP標記以DH群體為材料，都發現控制PPO活性的主效基因位于第2同源群染色體上。Anderson等[12]利用非整倍體小麥中60～62KDPPO活性的蛋白電泳，將PPO活性的主要控制位點定位在2D染色體上。張立平等[13]利用中優9507/CA9632的構建的71個DH系為材料在1年2種環境下種植，檢測到位于2AL和2DL上的兩個主效QTL，可分別解釋PPO活性變異的50.0%和29.1%。常成等[14]利用中國春的缺體-四體材料，將兩個PPO基因(PPO-1，PPO-2)分別定位在染色體2A和2D上，但未明確具體標記區間。

雖然人們對小麥籽粒PPO活性的QTL定位進行了研究，但是由于遺傳圖譜、群體類型和大小、數量性狀位點定位所使用的模型和環境等因素的影響，導致定位的結果在數目、位置和效應上研究結果不盡一致。因此進一步發掘和鑒定小麥籽粒PPO活性的QTL，研究它們的分布和遺傳效應，對于實現PPO活性的QTL精細定位、圖位克隆以及定向改良具有重要的理論意義和應用價值。本研究以花培3號和豫麥57構建的168個DH系為材料，在2年6種環境條件下，鑒定小麥籽粒PPO活性的基因位點，為了解小麥籽粒中PPO活性的遺傳基礎提供參考和依據，并為該性狀的遺傳改良提供基因資源和技術支撐。

1　材料與方法

1.1試驗材料和田間試驗

1.1.1DH群體高產、多抗的花培3號和綜合性狀優良的豫麥57雜交F1通過花藥培養，經染色體加倍獲得168個雙單倍體（DH）系。田間試驗于2009年在山東農業大學試驗農場種于3個生長環境。環境I為正常管理(于冬季、拔節期、開花期、灌漿期灌溉；拔節期、灌漿期追施氮肥兩次，分別為225 kg/hm2和75 kg/hm2；小麥生長期間降雨量和灌溉量分別為122.0 mm和270.0 mm)；環境II未追肥；環境Ⅲ為雨養。2010年在保定農科院，邢臺農科院，滄州青縣原種場種植，3個地點試驗地肥力均勻，管理同一般大田管理。隨機區組設計，3次重復，行長3 m，行距0.25 m。收獲籽粒后脫粒，測定籽粒PPO活性。

1.1.2小麥分子標記連鎖圖譜DH群體的分子遺傳圖譜由山東農業大學小麥品質育種研究室構建[15]。遺傳圖譜包括小麥21條染色體的324個位點(284個SSR、37個EST-SSR、1個ISSR和2個HMW標記)。圖譜全長2485.7 cM，2個標記間的平均遺傳距離為7.67 cM，形成24個連鎖群，分布于小麥的21條染色體上。

1.2籽粒PPO活性的測定

參照Anderson等[12]方法，采用D，L-DOPA、MOPS試劑和分光光度計測定籽粒的PPO活性。

1.3數據統計及QTL定位

利用SPSS17.0軟件進行表型數據的統計分析。根據上述遺傳圖譜,利用基于混合線性模型的Icimapping 2.2軟件，用完備區間作圖方法(Inclusive composite interval mapping,ICIM)[16]對6種環境下小麥籽粒多酚氧化酶活性分別進行QTL分析[17-20]，LOD閾值為2.5，Step值為1 cM。QTL命名參照等的方法。

2　結果與分析

2.1親本及DH群體的PPO活性

兩個親本的PPO活性差異明顯，花培3號的PPO活性明顯低于豫麥57(表1)；DH群體的PPO活性值呈連續性變異，變幅較大，符合正態分布，并存在明顯的雙向超親分離現象（圖1），表明小麥PPO活性為多基因控制的數量性狀，適合進行QTL定位分析。

表1　不同環境下小麥DH群體的PPO活性Table 1 PPO activity values of wheat DH population lines in different environment

圖1　DH群體PPO變異分布Fig.1 Distribution of PPO activity in DH population

2.2小麥籽粒PPO的QTL定位及效應估計

共檢測到位于染色體1B、2A、2B、2D、3A、5B和6B的15個QTL，可解釋7.99%～65.84%的表型變異（見表2）。在6個環境中都檢測到2D染色體上的主效QTL，但位置略有不同。另外一些效應較小的QTL，在各個環境中沒有重復出現。在山東3個環境和邯鄲點檢測到了相同的主效QTL，位于2D染色體上，標記區間為Xcfd168-Xbarc349.2（兩者的遺傳距離為1.6 cM），加性效應值為-0.42和-1.66，可解釋表型變異的11.65%～65.84%，增效基因來自于PPO活性高的父本豫麥57。保定點和滄州點的主效QTL標記區間分別為Xbarc349.2-Xbarc349.1和Xbarc349.1-Xcfd161，距離Xbarc349.1標記0.7 cM和5.3 cM，可解釋表型變異的11.34%和11.98%，加性效應值分別為-0.60和-0.51，增效基因來自于PPO活性高的豫麥57。山東環境Ⅰ和環境Ⅲ中分別檢測到2D染色體上的2個QTL，標記區間為Xwmc18-Xwmc17O.2，分別距離Xwmc17O.2標記0.4和3.4 cM，加性效應值分別為0.85和1.15，分別可解釋表型變異的17.24%和11.12%，增效基因來自于母本花培3號。

表2　小麥籽粒PPO活性的QTLTable 2 QTLof grain polyphenol oxidase(PPO)activity

圖2　小麥PPO活性QTL位點在SSR圖譜上的位置Fig.2 QTLfor PPO in SSR linkage map

3　討論

3.1環境和遺傳背景對QTL檢測的影響

數量性狀一般受環境的影響較大，如溫度、濕度、日照長短、土壤狀況等均可成為基因表達調控的成分，對QTL能否穩定遺傳和表達有一定的爭論。控制數量性狀的許多QTL與環境條件存在明顯的互作效應，不同的環境條件下，基因的表達與否以及表達量的多少會存在一定的差異，因此環境條件影響QTL的檢測。本研究檢測到位于染色體1B、2A、2B、2D、3A、5B和6B的15個QTL，表明控制小麥籽粒PPO活性的QTL分布比較廣泛。在6個環境下均能檢測到2D染色體上相同或相近QTL位點，且貢獻率都較大。這些QTL是比較穩定的，認為其是可靠的。對于那些只在單一地點檢測到的QTL，如5B染色體上的qPPO-5B，即使其具有較大的效應值，其定位結果只能作為參考。

3.2小麥籽粒PPO活性QTL定位結果的多樣性

本研究中，4個環境中都檢測出2D染色體同一主效QTL（標記Xcfd168-Xbarc349.2），貢獻率分別為65.84%、11.65%、22.73%、14.05%。該位點與Mares等[11](標記P41/M32-1)和張立平等[13](標記WMC41-P41/M32)所得的結果比較可以看出，主效QTL的染色體定位基本一致，但在染色體上的位點是不同的。究其原因，可能是構建群體的小麥親本材料不同，控制PPO活性的基因不同，研究方法不同或田間試驗準確性差異所致。前人研究有的所用DH群體較小，有的所用多態性引物較少，有的只在1年或1種環境下種植，有的可能田間試驗誤差較大，有的所用的分析軟件不同。本研究是在2年6種小麥生長環境下進行的，試驗地肥力均勻，田間管理細致，DH群體（168個系）較大，重組基因型豐富，群體內PPO活性變異廣泛，所用的多態性引物較多，構建的連鎖圖位點密集，所有這些都保證了本研究所定位位點的準確性。

4　結論

利用2個小麥品種花培3號和豫麥57雜交獲得的DH群體及其構建的小麥遺傳圖譜，檢測到控制小麥籽粒PPO活性的15個加性效應位點。其中，2D上主效QTL（標記Xcfd168-Xbarc349.2）在4個環境下都能被檢測到，貢獻率分別為11.65%～65.84%，增效等位基因均來源于花培3號。因此, Xcfd168可用于小麥多酚氧化酶活性的分子標記輔助育種。

[1]Baik B K,Czuchajowska Z,Pomeranz Y.Discoloration of dough for oriental noodles[J].Cereal Chem,1995, 72(2):198-205

[2]Bhattacharya M,Luo Q,Corke H.Time-dependent changes in dough color in hexaploid wheat landraces differing in polyphenol oxidase activity[J].J.Agric.Food Chem,1999,47:3579-3585

[3]Miskelly D M.Flour components affecting paste and noodle color[J].J Sci FoodAgric,1984,35:463-471

[4]Kruger J E.Effects of flour refinement on raw Cantonese noodle color and texture[J].Cereal Chem,1994,71:177-182

[5]Morris C F,Jeffers H C,Engle D E.Effect of processing,formula and measurement variables on alkaline noodle color-toward an optimized laboratory system[J].Cereal Chem,2000,77:77-85

[6]葛秀秀,何忠虎,楊金,等.我國冬小麥品種多酚氧化酶活性的遺傳變異及其與品質性狀的相關分析[J].作物學報,2003,29(4):112-116

[7]Jimenez M,Dubcovsky J.Chromosome location of genes affecting polyphenol oxidase activity in seeds of common and durum wheat[J].Plant breeding,1999,118:395-398

[8]葛秀秀,張立平,何中虎,等.冬小麥PPO活性的主基因+多基因混合遺傳分析[J].作物學報,2004,30(1):18-20

[9]Udall J.Important alleles for noodle quality in winter wheat as identified by molecular markers:[M].Moscow: University of Idaho.1997

[10]Demeke T,Morris C F.Wheat polyphenol oxidase:distribution and Genetic mapping in three inbred line populations[J]. Crop Sci.,2001,41:1750-1753

[11]Mares D J,Campbell A W.Mapping components of flour and noodle colour in Australian wheat[J].Australian Journal ofAgricultural Research,2001,52:1297-1309

[12]Anderson J V,Morris C F.An improved whole-seed assay for screening wheat germplasm for polyphenol oxidase activity[J].CropSci,2001,41:1697-1705

[13]張立平,葛秀秀,何中虎,等.普通小麥PPO活性QTL分析[J].作物學報,2005,31(1):7-10

[14]常成.小麥及近緣種屬籽粒硬度PPO性狀及分子機理研究[D].北京:中國農業大學,2005:52-57

[15]Zhang K P,Tian J C,Zhao L,et al.Detection of quantitative trait loci for heading date based on the doubled haploid progeny of two elite Chinese wheat cultivars[J].Genetics,2009,135:257–265

[16]王建康.數量性狀基因的完備區間作圖方法[J].作物學報,2009,35(2):239–245

[17]Li H H,Ye G H,Wang J K.A modified algorithm for the improvement of composite interval mapping[J].Genetics, 2007,106:361–374

[18]Li H H,Ribaut J M,Li Z L,et al.Inclusive composite interval mapping(ICIM)for digenic epistasis of quantitative traits in biparental populations[J].Theor Appl Genet,2008,116:243–260

[19]Zhang L Y,Li H H,Li Z L,et al.Interactions between markers can be caused by dominance effect of QTL[J].Genetics, 2008,108:1177–1190

[20]McIntosh R A,Devos K M,Dubcovsky J,et al.Catalogue of gene symbols for wheat[J/OL].[2009-06-30]. http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/wgc/2005upd.html

[21]McCouch S R,Cho Y G,Yano M,et al.Report on QTL nomenclature[J].Rice Gentetics Newsletter,1997,14:11-13

[22]Steffens J C,Hunt M D.Polyphenol oxidase.Genetic Engineering of Plant Secondary Metabolism[M].Newyork: Plenum Press,1994:275-312

[23]王鳳寶,付金峰,董立峰.多酚氧化酶活性與小麥抗穗發芽的關系及抗穗發芽新品種秦麥3號的選育[J].麥類作物學報,2006,26(5):97-100

[24]吳玉良,楊煜峰,丁守仁.無原花色素大麥突變體穗發芽的研究[J].浙江農業大學學報,1996,22(6):647-650

QTL Analysis on Polyphenol Oxidase Activity in Wheat Kernel

ZHAO Yong1,WANG Jie1,YANG Xue-fang1,LI Xiao-yun1,ZHANG Shu-hua2, TIAN Ji-chun3,YANG Xue-ju2*
1.CollegeofAgronomy,AgriculturalUniversityofHebei/CropGermplasmLaboratoryofHebeiProvince,Baoding071000,China
2.College of Life Sciences,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China
3.College of Agronomy,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China

Polyphenol oxidase(PPO)activity is a key factor causing the undesirable darkening of wheat(Triticum aestivum L.)products.A population of 168 doubled haploid derived from two elite Chinese wheat cultivars Huapei 3 and Yumai 57, grown in six different environments in two continuous cropping seasons.The Quantitative Trait Loci(QTL)for PPO activity was analyzed based on the constructed molecular linkage map of this population,including 324 markers covering the whole wheat genome.A total of 15 additive QTL were detected,the major QTL(Xcfd168-Xbarc349.2)was identified on chromosome 2D,accounting for 11.65%～65.84%of the phenotypic variance across four environments,they could be used in marker-assisted selection(MAS).

Wheat;polyphenol oxidase;Quantitative trait loci(QTL)

Q554+.1

A

1000-2324(2015)02-0189-05

2013-12-02

2013-12-21

河北省應用基礎研究計劃重點基礎(13966302d)

趙勇(1984-),男,河北滄州人,博士研究生.研究方向:小麥育種.E-mail:zhaoyong_0423@163.com

Author for correspondence.E-mail:shmyxj@126.com