煙草葉際細胞分裂素產生菌Y-P22的篩選、鑒定及其應用效果

邵蘭軍,劉凱,李宙文,張忠民,趙文婷,姚良同,杜秉海,丁延芹*

1.廣東中煙工業有限責任公司,廣東廣州510000

2.山東農業大學生命科學學院/山東省農業微生物重點實驗室,山東泰安271018

3.濟寧學院,山東濟寧273155

煙草葉際細胞分裂素產生菌Y-P22的篩選、鑒定及其應用效果

邵蘭軍1,劉凱2,李宙文1,張忠民3,趙文婷2,姚良同2,杜秉海2,丁延芹2*

1.廣東中煙工業有限責任公司,廣東廣州510000

2.山東農業大學生命科學學院/山東省農業微生物重點實驗室,山東泰安271018

3.濟寧學院,山東濟寧273155

通過形態學特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析將Y-P22鑒定為缺陷短波單孢菌（Brevundimonas diminuta）。該菌株是從煙草葉際分離的，具有較強的細胞分裂素產生能力。田間應用效果表明，該菌株能有效促進煙葉開片，提高煙葉的可利用性；感官評吸質量結果表明該菌株可以明顯提升煙葉內在質量。

煙草;葉際;細胞分裂素;缺陷短波單胞菌

隨著我國卷煙工業迅速發展，作為卷煙工業最重要原材料的煙葉已成為各大企業爭先搶奪的戰略物資，如何提高煙葉質量和產量更是各大企業關注的重點。提高煙葉質量的常規方法通常有兩個途徑：一是在煙草生長過程中通過合理施肥、尤其是葉面鉀肥的使用來提高煙葉產量和質量；二是在煙草加工過程中，利用物化手段適當處理來降低煙葉中的煙堿含量，從而提高煙葉的可利用性。近年來，微生物資源在煙草生產的各個領域的應用成為眾多科研工作者的研究熱點。研究發現應用微生物及其制劑不僅可以降低煙堿含量，還可以增加煙葉的香氣，改善煙葉品質[1,2]。較之以前方法具有無需特殊處理，沒有殘留，不會污染環境的優點。目前研究較多的可以用于煙草種植和加工的細菌種類主要有煙草節桿菌（Arthrobacter nicotianae)、嗜煙堿節桿菌(A.nicotinovorans)、氧化節桿菌(A.oxidans)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas puida)、芽孢桿菌（Bacillus spp.）等[3-6]。本研究對從煙草葉際分離的1株能促進煙葉開片，改善上部煙葉質量的菌株Y-P22進行鑒定，并對其應用效果進行研究，發現該菌可以明顯改善煙葉的內在質量，在生產中具有巨大的應用潛力和價值。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗菌株Y-P22為本實驗室從煙草葉際分離，能夠產生細胞分裂素。

1.1.2煙草品種K326。

1.1.3培養基0.5%煙葉，3%豆芽，1000 mL H2O。

1.2實驗地點

1.2.1室內實驗在山東農業大學微生物學系植物根際促生細菌研究室完成。

1.2.2田間實驗在遵義縣科技示范園完成，土壤類型為黃壤，中等肥力。

1.2.3感官質量煙葉評吸由黃果樹集團公司技術中心原料所完成。

1.3實驗方法

1.3.1Y-P22的鑒定形態特征和生理生化特征測定方法參閱文獻[7]。

1.3.2DNA提取和16S rDNA序列擴增DNA的提取參考文獻[7]。

引物為P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’和P2：

5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，由上海英俊生物技術有限公司合成。

PCR反應體系（25 μL）為：Taq 0.5μL,10×Buffer(Mg2+)2.5μL,dNTP(10 mM each)0.5μL,引物1μL,模板1μL,depc水19.5μL。

PCR反應條件為:95℃5 min,94℃1 min,56℃1 min,72℃1.5 min 30個循環,72℃延伸10 min。

用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒（3S Spin Agarose Gel DNA purification kit）純化PCR產物。

1.3.316S rDNA序列測定及分析PCR產物測序由上海英駿生物技術有限公司完成。測序結果用NCBI數據庫中的BLAST進行相似性分析。

1.3.4菌液制備用液體培養基接種新鮮菌種，搖床振蕩培養過夜，充分搖勻，用清水稀釋200倍備用。

1.3.5田間實驗在上部煙葉采摘前1月左右，將上述菌液噴施于煙草中上部葉片（以葉片背面為主）；間隔7 d后，進行第二次噴施，共2次。以傍晚噴施為宜，忌雨天噴施。以等量的清水和處理方式做為對照。處理45 d后，按照中華人民共和國煙草行業標準煙草農藝性狀調查方法調查煙葉的長勢，葉片顏色和葉面積。各種栽培管理措施按當地高產優質烤煙栽培技術精心管理。

1.3.6煙葉感官質量評吸評吸指標主要考核香氣特征的香氣質和香氣量，煙氣特征的濃度和勁頭，吃味特征的雜氣、刺激性和余味，以及物理特征的燃燒性和灰色等。具體按照行業內部標準執行，由黃果樹集團公司技術中心原料所給出結論。

2　結果與分析

2.1Y-P22形態特征

Y-P22菌落較小，圓形，邊緣整齊，濕潤，半透明，呈灰白色（圖1 A）。菌體細小桿狀，革蘭氏染色陰性，該菌在培養初期和培養后期形態上有明顯變化。菌體大小為0.25～0.5×0.75～1 μm，不產芽孢，儲存的菌種染色后著色很淺，模糊不清（圖1 B），培養24 h后染色深而清晰，菌體呈短桿狀（圖1 C）。

圖1　P22形態特征A菌落形態；B、C菌體的倒置攝像顯微照片（×1000）Fig.1 Shape of bacterial strain Y-P22A Colony;B＆C Photos of cell(×1000)

2.2生理生化特征

該菌不能利用葡萄糖和乳糖產酸產氣，接觸酶陽性，不產生吲哚，不能液化明膠，苯丙氨酸脫氨酶陰性。與Brevundimonas diminuta模式菌株的生理生化特征相符。

2.316S rDNA的特異性擴增和序列分析

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖2。

圖2　PCR產物電泳圖M為2 kb ladder；泳道1為PCR產物Fig.2 Electrophoresis map of PCR productsM is 2 kb ladder；Lane 1 is PCR products

以總DNA為模板擴增出大約1.5 kb大小的片段（圖2），純化后送公司測序。結果表明此片段大小為1338 bp，通過用BLAST比對，與Brevundimonas diminuta 2P02AA的16S rDNA序列（EU977662）相似性為99%。序列提交GenBank，收錄號為EU240971。

通過其形態學特征，生理生化特征和16S rDNA的序列分析初步將Y-P22鑒定為缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）。

2.4田間實驗結果

田間調查結果見表1。

表1　煙草生長情況調查表Table 1 Investigation on the growth of tobacco

從表1可以看出，由菌液處理的煙株其田間長勢較好，與對照處理相比，煙株的葉面積增加，并且處理后的煙株上二棚葉片的葉面積增加較為明顯，達到58.8%，而煙株頂葉葉面積增加約40%，從試驗的結果來看，菌液的使用有利于改善上部煙葉開張程度、改進煙葉品質，更有利于提高煙葉的可利用性。

2.5煙葉感官質量評吸

處理煙葉達到工藝成熟時進行采收，采用三段式烘烤工藝烘烤。送黃果樹集團公司技術中心原料所評吸，結果如表2所示。

表2　煙葉感官質量評吸結果Table 2 The sensory evaluation on tobacco

結果表明使用菌液的煙葉內在質量有較大提升，煙氣協調性較好，香氣有提升，甜度增加，口感改善具有一定的作用。同時，可降低勁頭，減少雜氣、刺激，說明菌液的作用效果顯著。

3　討論

本文所討論的菌種Y-P22分離自煙草葉際，以煙草浸出汁為培養基生長良好，它比其它來源的微生物菌種更有利于定殖于煙草葉片；實驗結果表明該菌株能同時提高煙草質量和產量。一方面，它可以產生細胞分裂素，在栽培期間噴施于葉片，可以有效的增加煙葉葉片面積，最高增加58.8%，大大提高了煙葉產量；另一方面，實驗煙葉的感官質量評吸結果較好，它提升了煙葉的內在質量，同時，可降低勁頭，減少雜氣、刺激。菌種Y-P22（Brevunmdimonas diminuta）原屬于假單胞菌屬，1994年Segers將其另立新屬－短波單胞菌屬（Brevunmdimonas）[7]。關于假單胞菌可產生香味物質，降低煙堿含量[8-10]早有報道，我們的實驗驗證了這一結論。但是微生物的使用同時提高煙葉產量，提升煙葉質量，屬于首次報道。利用微生物處理煙葉，可以降低煙堿含量，增加煙葉香氣，改善煙葉品質，提高煙葉質量等級，縮短發酵時間等優勢[11-14]；還可以減少化肥施用帶來的土壤板結和環境污染問題。從自然界篩選高效菌種資源，對于優質煙葉的生產具有深遠的意義，微生物在煙草行業中的應用具有重大經濟價值和社會價值。

[1]許自成,黃平俊,盧秀萍,等.不同覆蓋措施對大田烤煙葉片淀粉積累的影響[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2006,34(5):77-82

[2]宮長榮,劉霞,郭瑞,等.淀粉代謝及影響烤煙淀粉含量的因素[J].云南農業大學學報,2006,21(6):742-748

[3]Civilini M,Domenis C,Sebastianutto N,et al.Nicotine decontamination of tobacco agro-industrial waste and its degradation by micro-organisms[J].Waste Manage.Res.1997,15:349–358

[4]Detrglia M C,Tometsko A M.Separation of D-(+)-nicotine from a racemic mixture by stereospecific degradation of the L-(-)isomer with Pseudominas putida[J].Applied and Environmental Microbiology,1980,39:1067-1069

[5]Freudenberg W,K?nig K,Andreesen J R,et al.Nicotine dehydrogenase from Arthrobacter oxidans:A molybdenumcontaining hydroxylase[J].FEMS Microbiology Letters,1988,52:13-18

[6]Wada E,Yamasaki K.Degradation of nicotine by soil bacteria[J].Journal of the American chemical society, 1954,76:155-157

[7]東秀珠,蔡秒英.常見系統細菌學鑒定手冊[M].北京:北京科學出版社,2001:43-65;174-175

[8]Sharpell F H J.Comprehensive Biotechnology[M].Toronto:Pergamon on Press,1985:965-981

[9]毛多斌,何景福,李興波,等.生物技術在卷煙工業中的應用[J].鄭州輕工業學院學報(自然科學版),2005,20(3):32-34

[10]Eberhardt H J.The biological degradation of nicotine by nicotinophilic microorganisms[J].Beitr Tab Forsch Int, 1995,16:119–129

[11]夏振遠,雷麗萍,吳玉萍,等.降煙堿細菌-煙草節桿菌K9的分離及鑒定[J].中國煙草科學,2006,2:1-4

[12]宮長榮,袁紅濤,陳江華.烤煙烘烤過程中煙葉淀粉酶活性變化及色素降解規律的研究[J].中國煙草學報,2002,8(2):16-20

[13]羅家基,朱子高.微生物在煙葉發酵過程中的作用[J].煙草科技,1998(1):6

[14]鄭小嘎,張修國.真菌菌劑改善煙葉品質的初步研究[J].微生物學通報,2003,30(6):10-13

Screening,Identification and Application of the Strain Y-P22Producing Cytokinins in Phyllosphere of Tobacco

SHAO Lan-jun1,LIU Kai2,LI Zhou-wen1,ZHANG Zhong-min3,ZHAO Wen-ting2, YAO Liang-tong2,DU Bing-hai2,DING Yan-qin2*
1.China Tobacco Guangdong Industry Co.Ltd.,Guangzhou 510000,China
2.CollegeofLifeSciences,ShandongAgriculturalUniversity/ShandongKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,Taian271018,China
3.Jining University,Jining 273155,China

The Y-P22 was identified as Brevundimonas diminuta based on morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence.The strain was isolated from the tobacco phyllosphere.It can produce cytokinin.The results of field experiment and tobacco sensory evaluation showed that the strain could effectively improve the availability of tobacco and the quality of tobacco.

Tobacco;phyllosphere;cytokinin;Brevundimonas diminuta

TS41+4

A

1000-2324(2015)02-0194-04

2013-05-20

2013-06-02

廣東中煙工業有限責任公司資助項目(粵煙工15XM-QK[2011]-001)

邵蘭軍(1984-),男,湖北荊州人,碩士,農藝師,主要從事煙葉基地單元技術指導工作.

Author for correspondence.E-mail:dingyq6885@163.com